非洲豬瘟病毒的遺傳和抗原多樣性

崔茂盛（編譯）

（天津市畜牧獸醫研究所，天津 300381）

1 引言

非洲豬瘟病毒（ASFV）是病毒家族中唯一非常獨特的成員（Alonso et al.， 2018）。在家豬和野豬（Susscrofa）中，ASFV是高致病性的，能夠引起出血性及高致命性的ASF疾病，而且ASFV可在不同物種之間流行和暴發。近年來，ASF迅速蔓延，對全世界生豬產業造成巨大威脅（Cisek et al., 2016;Jurado et al., 2018; Kyyroet al., 2017;Nurmoja et al., 2017; Sanchez-Cordon et al., 2018; Vergneet al.,2017），可惜目前仍無安全有效的ASF疫苗可用。ASFV的毒力、免疫原性，更重要的是病毒表型和抗原多樣性等一直困擾著ASF疫苗研發進程（Arias et al., 2017; Revilla et al., 2018; Rock, 2017）。 認 識ASFV具有多樣性的關鍵是ASFV基因和基因組變異。ASFV的衣殼蛋白（p72）基因（B646L）是最早用于大規模評估ASFV遺傳多樣性的遺傳靶點之一（Bastos et al., 2003）。在B646L基因部分測序的基礎上，Bastos和同事鑒定了22個ASF基因型，建立了標準的ASFV基因型標記，但p72基因分型有時并不能夠提供足夠的分型分辨率來區分不同生物表型的病毒（Malogolovkin et al., 2015a）。 通 過對p54 （E183L）、p30 （CP205L）和B602L基因的研究，進一步提高了ASFV基因型分辨率（Bastos et al.,2004; Lubisi et al., 2007,2005; Gallar do et al., 2009; Nix et al., 2006）。目前，全基因組測序技術可為ASFV生物學多樣性研究提供有力手段。文章主要綜述ASFV遺傳和抗原多樣性的研究成果，并提出闡明ASFV多樣性的關鍵科學問題。

2 ASF基因和基因組

目前已測序的ASFV基因組長度不一，大小從170 101到193 886個堿基對。ASFV許多基因都是基于與痘病毒的同源性而命名（Dixon et al., 2013;Galindo and Alonso, 2017），并對與ASFV參考毒株ba71v及其他毒株的親緣關系進行了深入的研究（Chapman et al., 2008; Rodríguez et al., 2015; Yá?ez et al., 1995）， 但到目前為止ASFV許多核心基因的功能仍然未知。該核心基因區域存在著可變基因和基因間區域（例如中心可變區，或CVR等）。比較基因組分析還確定了一系列分布在基因組核心區域內外的基因，作為ASFV基因組中最可變的同源基因即CD2v/EP402R和c型凝集素/EP153R，可能是ASFV遺傳多樣性的來源（Chapman et al., 2011; de Villiers et al.,2010），與核心區域相比，位于末端的ASFV線性基因組區域在大小和基因含量上更具有差異性，被稱為左變區和右變區（LVR和RVR）。ASFV末端基因組區域主要由同源基因的多基因家族（MGF）控制。5個MGFs （MGF100、MGF110、MGF300、MGF360、MGF505）根據其平均氨基酸長度命名 （Almendral et al., 1990; Chapm an et al., 2008; Dixon et al., 2013; Gon zález et al., 1990; Pireset al., 1997; Yoz awa et al., 1994）。在功能基因組研究中，已經證明了MGF360的毒力和功能，并指出MGF505可能是病毒毒力因子之一，為疫苗的設計研發提供了新的思路（O’Donnell et al.,2016, 2015; Reis et al., 2016）。

自東歐首次發現ASFV以來，登記的ASFV序列數量迅速增加。來自愛沙尼亞、波蘭、拉脫維亞、立陶宛的ASFV基因序列顯示，ASFV基因組高度穩定，和親代ASFV/亞美尼亞2007毒株之間超過99%的同源性（FR682468）。然而，目前已在不同基因和基因間區域發現了多個單核苷酸的變化，包括翻譯蛋白的移碼和終止區（Fracz yk et al., 2016; Gallardo et al., 2018a,2018b; mietankaet al., 2016）， 這 些微小變化的生物學意義需要被充分研究。有趣的是，雖然大多數毒株的ASFV基因組GC含量平均約為38%，但GC含量相對較低的區域位于LVR和RVR以及中心區域（圖1）。GC含量的減少可能在病毒進化中發揮重要作用，也可能是GC堿基合成的生化成本較高的結果 （?marda et al., 2014）。

盡管對ASFV研究的歷史悠久，但可公開獲得的ASFV全基因組序列數量有限。GenBank包含42個完整的ASFV基因組序列，其中只有33個屬于野毒毒株。為了更好地掌握該病毒基因組的可塑性、抗原多樣性和進化特征，需要更多更完整的ASFV序列。在污水（Lohet al., 2009）和海洋環境（Ogata et al., 2009）中也發現了類似于ASFV序列，提示人們若利用宏基因組技術，可能會發現更多類似 ASFV 序 列（Kuhn et al., 2019）。一般來說，DNA病毒的突變率比RNA病毒低（Sanjuan et al., 2010）。利用貝葉斯統計評估ASFV基因區 域（B646L, CP204 L和B602 L/CVR）基因的進化率，B646L位點每年的進化率可能為RNA病毒的6.9×10-4。對來自東非的ASFV分離株研究表明，B602L基因小規模串聯重復序列（TRSs）數量有所增加（Lubisi et al., 2007, 2005），同樣在歐亞流行的ASFV毒株中，如高加索、俄羅斯和歐洲ASFV分離株的研究中也發現了TRSs （Gallardo et al., 2014; Golleret al., 2015; Kolbaso v et al., 2018）。從2014年到2018年，歐洲和中國的ASFV分離株中發現了越來越多的突變（Bao et al., 2019;Cisek et al., 2016; Gallardo et al.,2018a,2018b; Garigliany et al., 2019; Ge et al.,2018; Smietanka et al.,2016; Zhou et al., 2018）。但這些小規模的核苷酸突變與ASFV表型之間的生物學意義和相關性仍不清楚。

與單核苷酸突變相比，基因含量的變化更容易解釋病毒表型的變化（Zaniet al.，2018）。 同 源 基 因的ASFV多基因家族（MGF）是最易變的遺傳組成部分，相對于基因組的其他部分，其基因含量發生了巨大的變化，且出現了基因復制、序列分化、基因缺失和重組等現象，這些都會對ASFV基因組的結構產生很大的影響（De La Vega et al.,1990; Yá?ez et al., 1995）。 攜帶多個MGF拷貝的ASFV毒株具有更大的基因組（圖1），并通常與更強的毒性相關（Chapman et al.,2008; Krug et al., 2015; Rodríguez et al.,2015）。重組雖然是基因進化的主要驅動力（Barton, 2010），但其是否發生在ASFV毒株之間尚未有明確的證據。系統發育重構的研究表明，ASFV重組事件經常發生在MGF、E183L、B602L、EP153R 和EP402R（CD2v）等基因部位（Chap man et al., 2008; Michaud et al., 2013;N efedeva M. et al., unpublished）。總之，這些產生多樣性的進化過程驅動特定基因和編碼抗原的變化，這些研究結果可能會影響到疫苗接種策略或弱毒活疫苗的穩定性。

3 血清型的抗原多樣性

Malmquist在1960年首先利用紅細胞吸附試驗（HA）和紅細胞吸附抑制試驗（HAI）評估不同ASFV分離株在體外血清學交叉反應，鑒定出幾種ASFV抗原類型（Malmquist and Hay, 1960）。此 后，探討病毒抗原類型的決定成分成為研究的熱點。作為區分血清型特異性的有力工具，目前HAI已在俄羅斯聯邦病毒學和微生物學研究中心被廣泛使用，并建立了基于HAI的ASFV分類，以區分病毒抗原類型，確定了8個ASFV血清組并進行了詳細的鑒定。后來參考其他參數如血凝素密度（每個受感染細胞的紅細胞數），進一步改進了ASFV的 分 類（Makarov et al., 2016）。基于HAI分析的ASFV毒株篩選可用于開發一種潛在的弱毒活疫 苗（Sereda et al., 1992; Sereda and Balyshev, 2011）。 其 實，Malmquist W.A早已發現HAI分類的意義，他使用HAI分析開展了同源或異源性的ASFV分類。根據他的研究結果，感染后恢復期豬的血清可以抑制感染了同源ASFV的巨噬細胞中的HA。血凝吸附抑制的關鍵如圖2所示。幸運的是，Rodriguez等 人 在1993年 發現了負責介導HA的病毒決定成分為ASFV編碼的細胞CD2同源物，即CD2v蛋白的EP402R基因（Rodríguez et al., 1993）。 后 來，ASFV c型凝集素樣蛋白（EP153R基因）被認為是HA的輔助抗原（Galindo et al.,2000）。比較基因組研究已經確定這些基因是ASFV分離毒株中最具多樣性的基因（Cha pman et al., 2008; deVilliers et al.,2010），超過80株ASFV毒株系統發育分析顯示，CD2v/ c型凝集素基因型組與HAI血清學組相關，并顯示出CD2v/ c - electin與保護性免疫反應之間具有很強的相關性，該研究進一步提出了尚未在血清學上確定特征的其他潛在血清組（Malogolovkin et al., 2015b）。 由 于ASFV CD2v/ c型凝集素蛋白在體內具有特異性免疫保護和體外細胞免疫的特性，目前已與HAI 血清特異性關聯在一起，稱為血清型特異性ASFV抗原（Burmakina et al., 2019,2016; Malogolovkin et al.,2015b）。然而，CD2v和c型凝集素雖然在體內對介導交叉保護反應很重要，但在血清型特異性同源保護方面還不夠理想，暗示仍需鑒定更多的血清型特異性保護抗原。利用ASFV蛋白p30、p54和CD2v開展的亞單位疫苗目前也只具有部分誘導免疫保護作用，而且它們在促進血清型特異性應答方面的作用機制尚不清楚（Argilaguet et al., 2013; Barderas et al., 2001; Gómez-Puertas et al., 1998;Ruiz-Gonzalvo et al., 1996）。 利 用康復動物抗體介導的HAI仍是目前研究ASFV疫苗抗原多樣性和保護潛力的重要手段。ASF康復豬血清的抑制潛力取決于血清活性、病毒劑量和同源或異源病毒類型等等（Rodríguez et al., 1994; Ruiz Gonzalvoet al., 1986a, 1986b）。但是，HAI分類和感染抑制試驗的結果與“經典”病毒中和試驗的結果無關，這是一種影響體內保護的新機制。

ASFV抗原多樣性是阻礙ASFV疫苗開發的關鍵因素。最近研究表明，ASFV弱毒活疫苗（缺乏CD2v的ASFV 毒株BA71） 對ASFV Georgia/2007具有對異源病毒交叉保護的潛力（Monteagudo et al., 2017）。 當 前蛋白質組學研究也已證實ASFV蛋白質組同樣具有復雜性和靈活 性（Alejo et al., 2018）， 并發現了一些新的ASFV蛋白質（Kessler et al.,2018）。ASFV蛋白質組受到病毒和細胞本身嚴格的動態調控，所以可能會因病毒株和宿主細胞的差異而發生重大變化。由此可見，ASFV基因組和/或抗原多樣性可以影響宿主反應的多樣性，研究ASFV-宿主相互作用，有望將病毒基因型差異與表型多樣性進一步相關聯。

抗ASFV免疫是一種類型的特異性免疫，可能與血清特異性抗體的水平相關。當免疫動物被異源性ASFV株感染后往往使ASF病情加重或導致更嚴重的其他疾病，因為先前體內存在的免疫可能通過抗體依賴性增強（ADE）機制誘發更嚴重的發病（Khandia et al., 2018; Li et al., 2018）。雖然先前存在的ASFV免疫可能會影響T-細胞和抗體的反應，但ADE主要是由中和能力較低的交叉反應抗體引起的。盡管目前尚不清楚ADE機制是否發生在ASFV發病過程中，但在疫苗如何解決ASFV抗原多樣性問題方面，ADE機制仍可能具有重要意義。

4 結論

自1921年首次報告非洲豬瘟以來已近一個世紀，作為病毒家族中的一種獨特病毒，ASFV對世界生豬養殖的威脅比以往任何時候都大。ASFV的多樣性和復雜性是阻礙疫苗開發的關鍵因素。開展對歷史上的和不同的ASFV毒株基因測序分析，將有助于了解來自不同宿主的ASFV基因組之間的多樣性，有助于揭示ASFV進化關系，有助于確定抗原和表型變異的決定基因。基于ASFV CD2v的紅細胞吸附和比較基因組學，為識別與病毒抗原表型和交叉保護免疫相關的遺傳特征提供了一種可靠的方法。而識別其他血清型特異性保護性抗原，可能是設計特異性和有效性ASF疫苗所必需的。