牙齦卟啉單胞菌與細胞自噬相互作用研究進展

郭藝博，劉怡文，孫 蔚，張秀森，孫玲云，張頂彧，原 翔，高社干

細菌已經演化出多種入侵真核細胞并在細胞內定植、增殖的機制[1]。當外來病原菌侵入細胞后，會通過多種機制來逃避宿主細胞的免疫及降解作用，進而實現在細胞內定植生存。在細菌侵入細胞后，首先會被一個雙層膜的液泡，即吞噬小體包裹。在這一過程中，放線菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans，ACT)、李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，Lm)等可通過溶解雙層膜的吞噬小體進而在細胞中定植生存[2-3]；含有細菌的吞噬小體也可通過內源性途徑轉運至自噬小體從而進入自噬途徑，此時如牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)、流產布魯氏菌(Brucellaabortus，Ba)和嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila，Lp)等便可通過對自噬小體進行修飾調節，影響自噬途徑的正常進行，阻礙自噬小體與溶酶體融合而影響自噬過程中的降解作用，實現自噬逃逸，進而實現細菌在宿主細胞內定植生存[4-6]。本文將以Pg侵入正常牙齦細胞或食管上皮細胞為例，對外來病原菌侵入細胞后轉運至自噬途徑并發生自噬逃逸這一過程進行綜述，總結Pg在細胞內定植生存及增殖的機制。

1 自噬

1.1 細胞與自噬

自噬是一種細胞內的重要生理活動，用于降解受損細胞器和細胞質組分，以維持其穩態。從形成自噬小體到自噬小體向溶酶體轉運最終形成自噬溶酶體，這一過程是細胞新陳代謝、發揮其降解作用、清除細胞質組分及受損細胞器所必須的。其中自噬過程中被降解的細胞質組分特指在細胞分化、應激效應或暴露于細胞毒素等因素造成的受損胞內組分；被降解的細胞器特指在細胞受損或刺激后導致自身細胞器結構破壞及功能受損的細胞器[7-8]。目前已有大量研究證實了這一現象，比如，腦肝腎綜合征患者體內細胞中所形成的異常過氧化物酶體就是通過自噬途徑而被降解[9]。在鎮靜劑苯巴比妥攝入后引起肝臟細胞內質網的異常增殖、安妥明等降血脂藥物攝入后引起過氧化物酶體的異常增殖等現象中，一旦終止藥物的攝入，這些異常增殖的細胞器便會通過自噬途徑而被降解掉[10-11]。當細胞處于營養不良狀態時，通常通過對自身細胞內組分的非選擇性降解，攝取其中的碳水化合物和氨基酸等營養物質維持機體內環境的穩態[12]。自噬本身就是細胞內天然的維持機體穩態的一種重要的生理活動，在細胞受到刺激或處于營養不良狀態(缺乏氨基酸/生長因子等)時，細胞內的自噬活性會進一步得到加強[13]。在他莫昔芬治療乳腺癌的研究中發現，細胞可在藥物的作用下誘導體內自噬的發生，進而對癌細胞進行降解[14]。盡管自噬是可以高度調節地發揮降解作用的一種內源性途徑，但目前已有研究報道，在一些因缺乏生長因子而死亡的神經元以及X連鎖肌小管性肌病中，發生了不受自噬調控的細胞器降解甚至死亡的現象[15-16]。

早期自噬小體是一個由糙面內質網分泌的多層膜結構的液泡，其中包裹著尚未降解的受損細胞器以及細胞質成分[17-18]。隨后早期自噬小體通過獲得MAP-LC3微管結合蛋白以及溶酶體膜蛋白HsGsa7p和LAMP-1后演化為后期自噬小體，此時的自噬小體仍缺乏蛋白水解酶而無降解作用，須轉運至溶酶體并在微管蛋白介導下與溶酶體融合形成自噬溶酶體，進而發揮自噬途徑中的降解作用，對其中的細胞質成分及受損細胞器進行降解，所得降解產物還可為細胞內正常代謝活動提供能量[13]。

1.2 自噬相關的分子機制

肌動蛋白、異三聚體G蛋白、Ⅲ類磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)及其伴隨的p150蛋白等均為自噬小體形成及成熟過程所必須的分子[19]。此外，機體內同樣也存在抑制自噬發生的途徑，如FRAP/mTOR，是一種磷脂酰肌醇/蛋白激酶，可通過調節核糖體S6蛋白磷酸化水平升高而促進機體內蛋白質合成[20]，抑制自噬的發生[21]；Ⅰ類PI3K蛋白同樣也是自噬的一個負性調節蛋白[22]。還有文獻指出，由E1泛素激酶激活的一種蛋白結合系統同樣也是自噬小體形成所必須的[23]，這種蛋白結合系統已證明在包括人類在內的所有真核生物中均有存在[24-25]。目前已在酵母和哺乳動物細胞中證明，E1泛素激酶家族中的Gsa7p/Apg7p[23]，可通過催化Apg12p與Apg5p蛋白結合、Apg8p與磷脂酰乙醇胺結合調節自噬小體的形成及成熟過程[26]。Apg12p與Apg5p結合所形成的蛋白復合物可通過調節糙面內質網分泌自噬小體前體這一過程影響自噬小體的形成；Apg8p作為一種脂溶性蛋白，可與自噬小體膜結合，是自噬小體成熟過程中的一個關鍵蛋白，與人類MAP-LC3蛋白是同系物且均可定位于自噬小體的外膜上[27]。MAP-LC3蛋白可定位于自噬小體的外膜上，是自噬小體形成的標志，一旦加入渥曼青霉素、3-甲基腺嘌呤等抑制劑抑制自噬的發生，可發現MAP-LC3表達量明顯降低[27]。人類同源的Gsa7p和HsGsa7p蛋白可以促進hApg12p與MAP-LC3蛋白結合，進一步證明了蛋白結合系統對真核生物的自噬過程能夠起到一定的調控作用[24,28]。自噬小體形成后需要與溶酶體結合形成成熟的自噬小體，在微管蛋白、LAMP-2和SNAREs蛋白的共同作用下[19,29]，通過招募V-ATPase和溶酶體蛋白LAMP-1至自噬小體外膜，隨后與溶酶體融合形成富含酸性水解酶的成熟自噬小體，即自噬溶酶體進而發揮其降解作用。

1.3 細菌感染與細胞自噬

許多細菌已經演化出多種入侵真核細胞并在細胞內發生定植、增殖的機制[1]。細菌進入細胞后首先會被吞噬小體包裹，接著在Rab GTPases蛋白的調控下介導吞噬小體與核內體發生動態轉運，進而與溶酶體融合形成成熟的吞噬小體即吞噬溶酶體，發揮其降解作用[30-31]。吞噬溶酶體中富集大量蛋白水解酶，促使其包裹的大多數病原體的死亡和降解，抵御了胞內病原體的進一步擴增。而一些研究發現進入胞內的病原體可通過干擾吞噬小體向吞噬溶酶體成熟這一過程，逃逸宿主細胞的降解作用，以實現病原體在胞內的定植生存。如包裹結核桿菌的吞噬小體，由于缺乏V-ATPase，使得吞噬小體無法與溶酶體結合而形成成熟吞噬小體的過程，繼而使得結核桿菌在胞內逃逸被降解的過程，實現在胞內的定植生存[32]。因此，一些進入胞內的病原體可能通過干擾吞噬小體的形成及成熟過程而逃逸宿主細胞的降解作用，進而實現在胞內定植生存。

進入胞內后的病原體除了被吞噬小體轉運至溶酶體之外，還能被轉運至自噬小體進入自噬途徑。如Pg感染食管上皮細胞，在加入渥曼青霉素或3-甲基腺嘌呤等抑制劑預處理食管上皮細胞后，再用Pg感染細胞發現，細菌在胞內無一存活[6,20,33-34]。這些數據表明外來病原體進入胞內后，通過刺激細胞的自噬發生，使得病原體侵入細胞后由吞噬小體轉運進入自噬途徑，繼而在自噬過程中逃逸宿主細胞的降解作用，實現在胞內的定植生存。目前已經有研究表明自噬水平會隨著侵入病原體的增多而升高[35]。此外還有研究發現細胞在受病原體感染引起的細胞自噬中，其中的自噬相關蛋白HsGsa7p的分布明顯不同于由饑餓而引起的細胞自噬。在細胞由饑餓而引起的自噬中，HsGsa7p蛋白相對分散，分布于整個細胞質當中，當加入渥曼青霉素抑制自噬途徑時，HsGsa7p蛋白則定位于高爾基體上。在細胞由病原體感染而引起的自噬中，HsGsa7p聚集明顯，附著于自噬小體外膜上。當加入渥曼青霉素抑制自噬途徑時，HsGsa7p同樣定位于高爾基體上[36]。因此，進入胞內的病原體同樣也可能通過干擾自噬小體的形成及成熟過程擺脫其被降解的命運，進而實現在胞內定植生存。

2 細菌侵入細胞后能夠向自噬小體轉運

目前對于細菌在侵入細胞后是直接被轉運至溶酶體中進行降解還是進入自噬途徑，仍沒有一個明確的結論。如Pg在其進入細胞被包裹于吞噬小體后，能直接向自噬小體轉運進入自噬途徑，而不是直接被溶酶體降解，進入自噬途徑后的Pg就能夠利用自身的Ⅸ型蛋白分泌系統對自噬小體進行修飾調節[37]，利用自噬小體所包裹的內源性蛋白為其在胞內定植生存供給能量[38-40]；此外如嗜肺假單胞菌，在侵入細胞后被吞噬小體包裹，可通過icm/dotⅣ型蛋白分泌系統介導下轉導順式作用信號，激活自噬途徑，將細菌由吞噬小體向自噬小體轉運并在自噬過程中誘發自噬逃逸，最終實現在胞內的定植及增殖[41-43]；Ba同樣也可以在icm/dotⅣ型蛋白分泌系統的介導下實現其在胞內的定植及增殖[44-45]。這些研究說明細菌侵入細胞被吞噬小體包裹后，可以通過一系列蛋白分泌系統激活自噬途徑，介導細菌從吞噬小體向自噬小體轉運，并誘發自噬逃逸，最終實現細菌在胞內定植增殖[46]。而如果細菌進入細胞后沒有自身蛋白分泌系統的調控，那么細菌進入細胞被吞噬小體包裹后將直接轉運進入自噬途徑，激活自噬的發生，由自噬小體將外來細菌包裹起來，并通過自噬途徑轉運到溶酶體中形成自噬溶酶體，發揮對細菌的降解作用。自噬常會因外界病原體感染、高溫、輻射、饑餓、藥物等作用而被激活[14,47-49]。因此，受到外來病原體侵入的細胞均可通過激活自噬途徑形成自噬小體，并與溶酶體結合形成自噬溶酶體，在蛋白水解酶的作用下實現對外來病原體的清除降解作用。

3 細菌在自噬小體中發生自噬逃逸

正常情況下，細菌進入細胞質后首先會被吞噬小體所包裹，繼而再通過與核內體相互作用演化成具有核內體特征的液泡，隨后通過與溶酶體結合，在溶酶體水解酶的作用下實現宿主細胞對胞內細菌的降解[22]。然而對于Pg而言，在進入細胞后能夠通過吞噬小體迅速與早期核內體結合，隨后向自噬小體轉運，而避免了進入細胞后直接被溶酶體降解的命運[6,50-51]。包含細菌的核內體能夠向自噬小體轉運這一現象說明細胞內存在著介導內吞與自噬相互作用的機制[9,17,52]，這一機制同樣也介導核內體與自噬小體的融合[53]。核內體與自噬小體融合，揭示了Pg進入細胞后向自噬小體轉運的這一重要途徑。

早期的自噬小體是由糙面內質網(rough endoplasmic reticulum，RER)內陷而形成的具有多層膜結構的液泡，包裹著尚未降解的細胞質成分及受損的細胞器[13]。利用免疫熒光方法檢測Pg侵入細胞后與內質網蛋白的共定位實驗中發現，胞內的細菌與內質網蛋白存在大量的共定位現象[6,54]，說明侵入細胞后的細菌能夠與早期自噬小體結合。此外Garin還利用免疫熒光檢測了胞內細菌和內質網中其他與核內體相關的蛋白(鈣網蛋白、鈣聯接蛋白、GRP78、Erp29)的共定位情況，發現胞內細菌能夠與內質網蛋白結合產生共定位的同時，還改變了內質網在細胞質中的分布：被細菌感染后的細胞在其細胞質中可見自噬小體周圍富集了大量內質網，而未被細菌感染的細胞其自噬小體周圍并未發現內質網。

HsGsa7p作為一種介導早期自噬小體形成的關鍵蛋白，在免疫熒光實驗中，檢測在經Pg感染后的細胞中胞內細菌與HsGsa7p共定位的實驗中發現[6]，HsGsa7p同樣也能與胞內細菌發生大量共定位。隨著自噬小體的成熟，HsGsa7p與Pg的共定位逐漸減少。當加入渥曼青霉素抑制自噬的發生時，可見Pg與溶酶體蛋白cathepsin L發生大量共定位。這表明，HsGsa7p作為自噬小體的關鍵蛋白，同樣也是在細菌通過自噬途徑建立細菌生存所需的微環境這一過程中的重要因子。

4 Pg自噬途徑與胞內定植、增殖

4.1 Pg通過自噬途徑在胞內定植

在早期自噬小體成熟過程中，通過獲得一個溶酶體相關的膜蛋白LAMP-1(同樣也被稱作溶酶體糖蛋白-LGP120)和一個保留糙面內質網蛋白的V-ATP酶從而形成后期自噬小體。后期自噬小體通過與溶酶體結合形成成熟的自噬小體即自噬溶酶體，由其中的酸性水解酶對自噬小體中的內容物進行降解[17]。自噬溶酶體是單層膜結構，包含著被降解的細胞器及細胞質成分，其降解內容物后所產生的多肽及氨基酸可重新回收利用合成新的蛋白。然而對于Pg而言，在其感染細胞后，會通過阻礙自噬小體與溶酶體結合形成自噬溶酶體這一過程來實現自噬逃逸，避免被降解。Pg在侵入細胞后在一個由單層膜包裹的液泡中實現在胞內的定植及增殖，且該液泡周圍無后期自噬小體標志蛋白LAMP-1和溶酶體標志蛋白cathepsin D附著，表面僅有糙面內質網蛋白附著，此時的單層膜液泡很可能是一個被細菌修飾后的自噬小體，無法再與溶酶體結合形成自噬溶酶體，發揮其降解作用[6]。此外根據嗜肺假單胞菌感染細胞后的免疫熒光實驗結果顯示[55]，嗜肺假單胞菌周圍有大量后期自噬小體標志蛋白LAMP-1和溶酶體標志蛋白cathepsin D附著，也就意味著嗜肺假單胞菌侵入細胞進入自噬途徑后，很可能是被轉運至自噬溶酶體中，通過對自噬溶酶體進行調節修飾，從而避免被宿主細胞降解實現自噬逃逸。因此外來細菌病原體侵入細胞后，不僅能在自噬小體中發生逃逸，還能在富集多種水解酶的自噬溶酶體中發生自噬逃逸，進而實現在胞內定植。

4.2 Pg通過自噬途徑在胞內增殖

細菌侵入細胞后轉入到自噬途徑，不僅逃避了直接被宿主細胞降解清除的命運，實現自噬逃逸，同時在自噬小體中還能募集蛋白底物，為細菌在胞內的增殖代謝等活動供給能量。尤其是對于Pg而言，其在胞內定植需要大量多肽和氨基酸作為碳源，為其增殖代謝活動提供能量[10,12]。而細菌在胞內運轉，對真核生物的正常生理功能也造成了影響。

基于含有Pg的自噬小體因無法與溶酶體融合而缺乏酸性水解酶發揮其降解作用這一現象，細菌在胞內自噬過程中對蛋白底物的招募很可能是通過細菌自身的蛋白激酶來進行。有研究報道，Pg在侵入人類冠狀動脈上皮細胞后，與未感染細菌的人類冠狀動脈上皮細胞相比，長壽內源性蛋白酶的量明顯增加[56]。此外在含有Pg的后期自噬小體內可觀察到大量分泌液泡富集，這是由于Pg的牙齦孢囊正在分泌并傳遞其蛋白酶至自噬小體中攝取胞內蛋白為自己供能[57]，同時這也是一種細菌降解并攝取宿主細胞蛋白為自己在胞內生存所必要的方式。這些蛋白酶大部分被包裹于后期自噬小體中，為宿主細胞供能并維持宿主細胞活力。對于Pg而言，可能是通過自身的蛋白酶降解并攝取宿主細胞中的蛋白作為碳源，為它們在胞內的代謝活動提供能量。因此，侵入胞內的Pg可能是通過在自噬小體中降解并攝取其中的細胞質成分及受損細胞器成分中的多肽，從而為其在胞內的代謝活動提供營養，供給能量。

5 結論與展望

細菌侵入細胞后，可以通過逃避宿主細胞的降解作用來實現胞內定植，大部分的細菌都是被包裹于吞噬小體，通過阻礙吞噬小體向溶酶體轉運這一過程來逃逸宿主細胞的降解。Pg在進入細胞被吞噬小體包裹后，能夠向自噬小體轉運而非溶酶體，進入自噬途徑后，通過吞噬小體與自噬小體融合，促進早期自噬小體的形成，將Pg連同細胞質內蛋白一起包裹于早期自噬小體中。隨著早期自噬小體上不斷富集大量溶酶體膜蛋白，便完成了由早期自噬小體向后期自噬小體進化的過程。包裹著Pg的后期自噬小體可通過與溶酶體結合獲得其中的酸性水解酶，形成成熟的自噬小體，即自噬溶酶體，發揮對其內容物的降解作用。而一旦自噬途徑受到PgⅨ型蛋白分泌系統的調控修飾作用，包裹著Pg的后期自噬小體便無法與溶酶體融合形成自噬溶酶體，反而在自噬小體內形成了適宜Pg在胞內定植生存的微環境，同時Pg可通過自身的蛋白激酶降解并攝取自噬小體中所包裹的細胞質成分，為Pg在胞內的定植生存提供能量。

若將待感染的細胞中加入阻礙自噬發生的藥物或抑制劑，再用Pg感染細胞可發現胞內細菌活力明顯下降，此時的細菌進入細胞后仍被包裹于吞噬小體中，但由于自噬途徑受到抑制，此時胞內的細菌只能在吞噬小體的作用下被轉運至溶酶體中進行降解，最終被宿主細胞清除。因此對于Pg而言，侵入細胞后，只有通過進入自噬途徑在蛋白分泌系統的作用下對自噬小體進行一系列調控修飾，才能避免被宿主細胞降解，實現自噬逃逸。這一機制為清除Pg提供了新思路：在Pg感染細胞后，使用藥物或抑制劑阻礙細胞自噬的發生，便能夠大大降低Pg的活力，阻礙其在胞內定植生存。

目前仍有一些細菌在胞內的定植生存機制尚未揭示，有些可能仍與自噬途徑有著密不可分的關系。在由細菌侵入細胞而引起的自噬逃逸中所涉及的蛋白及細胞器也仍需繼續探索和驗證。可以通過對病原菌在胞內定植生存的機制及其相關蛋白等方面進行研究，加深對病原菌發生自噬逃逸相關機制的理解，同時也為臨床相關治療提供新的方向和思路。