無創性分子標志物用于新生兒壞死性小腸結腸炎早期診斷的研究進展

王雪芳，胡勇

(上海交通大學附屬兒童醫院 上海市兒童醫院 新生兒科，上海 200062)

新生兒壞死性小腸結腸炎(NEC)作為新生兒重癥監護病房(NICU)最常見的胃腸道急癥，是導致早產兒和低出生體重兒(LBW)死亡的重要原因之一。近年來，隨著極低出生體重兒(VLBW)、LBW病死率的下降，NEC的發病率逐漸升高。在中國，VLBW和LBW的NEC發生率分別為4.5%和2.5%，Ⅱ、Ⅲ期NEC死亡率為41.7%[1]。NEC發病急、進展快，早診斷、早治療對提高NEC患兒生存率和遠期治愈率有著極為重要的意義。依據NEC的病因學和臨床癥狀，目前正在開展的早期臨床診斷研究可以歸化為兩大類：一是檢測糞便中腸道菌群譜及糞便揮發性有機化合物(VOCs)；二是測定血漿、糞便和尿液中的炎癥標志物，如腸脂肪酸結合蛋白(I-FABP)、尿血清淀粉樣蛋白A(SAA)、糞鈣衛蛋白(FC)、腸堿性磷酸脂酶(IAP)及血清C反應蛋白(CRP)、腸三葉因子(ITF)、白介素(IL)-6、IL-8、IL-10等。作者著重就從糞便、尿液中尋找無創性分子標志物用于早期診斷NEC的最新研究進展進行綜述。

1 I-FABP

I-FABP是一種小的胞質蛋白，主要存在于小腸的腸上皮細胞中，在細胞分裂后被釋放入血。I-FABP很容易從腎臟排出，因此可以在組織損傷后數小時內通過尿液檢測[2]。NEC的特點是腸壁完整性缺失，因此I-FABP也許是一種較有前途的生物標志物。Gregory等[3]研究了70對病例與對照，NEC組發病7 d內的尿I-FABP中位濃度均高于非NEC組。使用98例嬰兒(49對病例與對照)的一個子集進行分析，其NEC組的尿樣均在診斷NEC的3 d內獲得。其中，尿I-FABP中位濃度在NEC組中較高，并且在所有Bell分期中均顯著升高。受試者工作特征曲線(ROC曲線)顯示：在NEC發病的7 d內，I-FABP>13.3 ng·ml-1預測NEC的敏感性為60%，特異性為78%；在NEC發病的3 d內，I-FABP>13.9 ng·ml-1預測NEC的敏感性為65%，特異性為84%。由此認為尿I-FABP可能是NEC發病的7 d內一個有用的預測因子，在NEC發病的3 d內更具有預測力。Schurink等[4]檢測了37例(男24例、女13例)新生兒的血漿I-FABP和尿I-FABP，發現NEC組(22例)的血漿I-FABP和尿I-FABP水平明顯高于非NEC組(15例)，I-FABP在發病后8 h內最高，并隨著時間的推移逐漸下降。診斷NEC的臨界值為血漿I-FABP 9 ng·ml-1和尿 I-FABP 218 ng·ml-1。Coufal等[5]招募了42例疑似NEC的患兒和12例健康兒作為對照，通過ELISA檢測其尿液標本，發展為NEC的患兒中，尿I-FAPA濃度在NEC早期就明顯升高，其陽性預測值達100%。然而，Yang等[6]對I-FABP用于NEC診斷相關的13個研究的結果進行了Meta分析，認為血漿I-FABP是診斷NEC的一種很有前途的生物標志物，具有很高的特異性，但由于其敏感性中等，實用性受到了限制。而尿I-FABP和尿I-FABP/Cr對診斷價值不大，尿I-FABP聯合其他分子標志物對高危早產兒的臨床應用可能具有更大的應用價值。由于目前實驗中納入研究的樣本量都較小，因此需要更多高質量的研究來確定I-FABP是否可成為早期識別NEC的分子標志物。

2 SAA

SAA是一種急性期蛋白，在刺激性細胞因子誘導下由肝臟和腎臟迅速合成。Reisinger等[7]對62例臨床懷疑NEC的新生兒(29例最終診斷為NEC)進行尿I-FABP、尿SAA、FC定量檢測。采用多變量Logistic回歸模型計算尿I-FABP+尿SAA和尿I-FABP+FC聯合應用的診斷準確率。結果顯示尿SAA聯合尿I-FABP不能提高尿I-FABP的診斷準確率。隨后，Reisinger等[8]對這29例新生兒NEC進行尿I-FABP、尿SAA、尿C3a、尿C5a和FC的測定，結果顯示，與輕度NEC(定義為內科NEC或Ⅰ、Ⅱ期NEC)相比，嚴重NEC(定義為手術性NEC、致死性NEC或Ⅲ期NEC)新生兒尿SAA水平顯著升高。根據Bells修正標準，確定了Ⅱ期和Ⅲ期NEC組SAA的最佳臨界值為40.7 ng·ml-1。同一組還報道了尿SAA和血清血小板計數聯合應用可將鑒定靈敏度提高到94%。這些結果提示，尿SAA可能是識別嚴重NEC的一個潛在標志物，聯合血小板計數可提高SAA測定的準確性。

3 FC

FC是一種由鈣和鐵合成的36 kDa的蛋白質，可反映腸道炎癥情況。Yoon等[9]的研究結果示NEC組較非NEC組FC水平明顯升高。MacQueen等[10]隨訪了30個早期X線檢查排除NEC的患兒的糞便標本，并根據其最終結局分組。結果顯示新生兒NEC組初診及隨訪FC水平均高于無NEC組。Zhang等[11]采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定早產兒NEC組(17例)和非NEC組(23例)的FC濃度，NEC組FC中位值明顯高于非NEC組，且NEC Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期差異有統計學意義。同時，FC水平與血小板計數呈負相關，與CRP呈正相關。無獨有偶，Abdelkader等[12]檢測了29例NEC患兒與29例非NEC患兒的糞便樣本，與非NEC組相比，NEC組FC水平高得多，且FC水平與NEC分期呈正相關。但也有一些研究者如Van Zoonen等[13]認為，早產兒出生后的第1周FC濃度高，個體間差異大，廣泛的個體內變異排除了在高危嬰兒NEC早期檢測或預測中連續使用FC的可能性?？傊現C可能是篩查高危新生兒亞群中NEC的一個有效的生物標志物。然而，由于FC是一種非特異性炎癥標志物，因此對NEC的診斷沒有特異性。但是將其與其他指標相結合可能會增加其特異性。Reisinger等[7]對62例臨床懷疑NEC的新生兒(29例最終診斷為NEC)進行尿I-FABP、尿SAA、FC定量檢測。采用多變量Logistic回歸模型分析尿I-FABP與FC聯合應用的診斷準確率。結果顯示FC和尿I-FABP的聯合應用顯著提高了準確性。尿I-FABP與FC聯合檢測的敏感性為94%，特異性為79%，但不能區分NEC Bell Ⅲ期和Bell Ⅱ期。由此可見，多種分子標志物聯合用于診斷NEC的可行性可成為未來研究的一個重要方向。

4 VOCs

NEC炎癥標志物的檢測目前主要集中在I-FABP、SAA、FC等，和腹部X線平片相比，糞便炎癥標志物的檢測特異性比較差，多數處于臨床研究階段，沒有直接應用于臨床診斷。目前臨床診斷NEC的主要方法還是依賴于腹部X線平片和腹部超聲檢查，這種檢測是基于腸道內氣體產生量，特別是門靜脈內的氣體含量。鑒于NEC臨床檢查以腸道內氣體產生量為主要指標，腸道內某些揮發性有機化合物似乎有望成為診斷NEC的標志物。De Meij等[14]認為，從臨床癥狀出現前2～3 d起，NEC組(13例)的糞便VOCs譜可與非NEC組(14例)相鑒別，利用eNose進行VOCs分析有可能成為早期預測NEC的非侵入性工具。Garner等[15]從新生兒重癥監護病房內早產兒的每日糞便樣本(共65份)中提取了224種不同的揮發性有機物。非NEC組的VOCs數量隨年齡增長而增加，而NEC組診斷前后的幾天內，VOCs的提取量減少。此外，在非NEC組中檢測到的4種特定酯(2-乙基己基乙酸酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯和十六酸乙酯)，在NEC發生前4 d內的所有糞便樣本中始終未被檢測到。初步研究表明，從糞便中提取VOCs可用于鑒別NEC高危嬰兒。Probert等[16]從1 326例嬰兒中采集了7 000多份糞便標本，并對32例確診NEC嬰兒診斷前的標本進行了檢測，NEC組和非NEC組的VOCs存在差異，在確診前3～4 d 似乎充當了NEC的分子標志物。但在確定個別揮發性有機化合物作為潛在的NEC分子標志物的有用性之前，還需要更大的樣本量、進一步的數據集驗證。

5 糞便中腸道菌群譜

細菌在NEC的發病機制中起關鍵作用，無菌動物不能發展成NEC[17]。NEC患兒腸道菌群是否有其獨特性并能用于輔助診斷？許多研究者為此作了大量研究。Morrow等[18]檢測了11例NEC嬰兒和21例非NEC嬰兒的糞便和尿液樣本，認為早期腸道微生物失調的特征和潛在益生菌的存在與否，可以作為非侵入性生物標志物，共同預測早產兒的NEC。結合早期的微生物因素，他們獲得了一個非常高的NEC預測值(88%)，但鑒于該研究的樣本量較小，且在單一人群中進行，應謹慎進行這一初步估計。Zhou等[19]對取自12例NEC嬰兒和26例年齡匹配的非NEC嬰兒的共312個糞便樣本進行了16sRNA基因的縱向分析，結果提示，腸道微生物中最常見的是腸桿菌屬，95%的樣本中都有腸桿菌，這表明該菌可能代表早產兒早期(0～60 d)的縱向核心屬。早期發病的NEC患者與對照組的微生物群的差異最為明顯。在接近NEC發病時，早期發病的NEC患者中，梭形芽孢桿菌的狹窄梭菌的豐度顯著高于對照組，晚期發病的NEC患者中，變形菌屬中的大腸桿菌/志賀氏菌在發病前呈上升趨勢，并在發病前6 d顯著高于對照組。晚期發病的NEC患者在發病前1～3 d，來自變形桿菌屬的阪崎腸桿菌也明顯高于對照組。因此，與NEC相關的特異性感染可能因嬰兒發病年齡的不同而不同。Warner等[20]研究了122例嬰兒的2 492份糞便樣本，其中28例嬰兒患NEC，94例非NEC嬰兒作為對照，NEC患兒糞便中的微生物群落結構與對照組相比有顯著差異，這些差異只有在出生后的第1個月才出現。發展為NEC的嬰兒中，變形桿菌(腸桿菌科)的比例增加，陰性桿菌和梭菌-陰性桿菌的比例降低。這些關聯性在妊娠小于27周的嬰兒的隊列中最強。Roz′e等[21]對15例NEC患兒和57例非NEC患兒進行了16sRNA基因測序，結果顯示，在屬級，梭狀芽孢桿菌與NEC顯著相關。Pammi等[22]通過系統回顧及Meta分析發現，早產兒患NEC前的微生物失調表現為變形桿菌相對豐度增加，厚壁菌和擬桿菌相對豐度降低?，F有研究揭示了在屬級水平上早產兒患NEC前的腸道微生物失調，其結果是否能用于臨床診斷尚需進一步研究。

6 IAP

IAP作為腸道內表達的內源性蛋白質，是無創檢測的理想選擇。Rentea等[23]利用新生大鼠模型證明早產及配方喂養與抑制IAP的表達和活性有關，而這兩者都可能增加NEC的風險，對有NEC風險的新生兒早期腸內補充IAP可能有治療作用。Heath等[24]檢測了136例早產兒的糞便，分別用熒光法和免疫法測定IAP的酶活性和相對豐度，認為糞便中IAP蛋白含量高、IAP酶活性低與NEC的診斷有關，可作為NEC的有用生物標志物，并認為IAP是唯一能夠區分NEC和敗血癥的生物化學物質。

除上述無創性標志物外，尿液來源的尿補體C3a和C5a[8]、前列腺素E2主要尿代謝物[25]以及糞便來源的糞乳鐵蛋白[26]等也有利于早期發現NEC。

近幾十年來，NEC分子標志物研究取得了穩步進展。上述標志物對早期診斷NEC、判斷其嚴重程度及治療方案選擇有一定的指導意義，但是目前尚無法確定一個比較準確的診斷臨界值及其相關的敏感度、特異性，大樣本、多中心研究將是今后努力的方向。