白頭翁湯對結直腸癌小鼠炎性微環境的影響

節陽華， 楊曉蓓， 陳衛東

（1. 新疆醫科大學附屬中醫醫院腫瘤放療科，新疆烏魯木齊 830000；2. 新疆烏魯木齊市中醫醫院肛腸科，新疆烏魯木齊 830000；3.西南醫科大學附屬中醫醫院肛腸科，四川瀘州 646000）

結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，發病率高達30/10 萬～50/10 萬，在世界范圍內發病率居第3位[1-2]。新疆屬于高寒地帶，人們的飲食以高熱量、高脂肪食物為主，新鮮蔬菜攝入較少，以致缺乏大量維生素，這成為了結直腸癌的易感因素。本課題組前期研究[3]表明，白頭翁湯治療結直腸癌患者的血液差異表達基因有159 個，其中38 個基因上調、121個基因下調，功能涉及趨化因子的活動、細胞因子活性及腫瘤炎癥微環境等。炎癥可以促進上皮類腫瘤的發生，炎癥的刺激導致腫瘤釋放許多直接促進其自身生長的炎癥因子及其受體調控網絡，從而構成了炎癥微環境，直接影響著腫瘤的發生、發展、復發、轉移及藥物的治療反應[4-7]。本研究通過建立結直腸癌炎癥微環境小鼠模型，觀察白頭翁湯對小鼠結直腸癌炎癥微環境基因陣列、通路及細胞因子的影響，探討其作用機制，以期為白頭翁湯治療結直腸癌提供依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1. 1實驗動物與細胞SPF 級雄性6～8 周齡小鼠24 只，體質量（20 ± 2）g，購自新疆醫科大學動物中心，許可證號：SCXK（新）2016-0003，實驗動物質量合格證號：65000700000993。動物飼養于新疆醫科大學動物中心，室溫22 ～24 ℃，濕度55%，自由取食飲水。人HCT-116 結直腸癌細胞株由新疆醫科大學動物實驗室提供。

1. 2藥物及制備白頭翁湯由白頭翁15 g、黃連6 g、黃柏12 g、秦皮12 g 組成。上述中藥材由新疆醫科大學附屬中醫醫院提供，水煎、濃縮成1.0 g/mL濃度藥液備用，制備工藝按照國家中醫藥管理局中藥制劑管理規范實施[2007]20號操作，由本院制劑室完成。

1. 3試劑與儀器脂多糖（LPS）（美國Sigma 公司）；白細胞介素（IL）-17、IL-23、腫瘤壞死因子（TNF）-α酶聯免疫吸附分析（ELISA）檢測試劑盒均購自杭州聯科生物技術股份有限公司；Janus 蛋白酪氨酸激酶（JAK）2 抗體、磷酸化JAK2（p-JAK2）（Tyr1007）抗體、信號轉導與轉錄激活子（STAT）3抗體、磷酸化STAT3（p-STAT3）（Tyr705）抗體、RT2Profiler PCR Array、 QuantiNava SYBR Green Kit、RT2First Strand Kit（12）（德國Qiagen 公司）；RT 反 轉 錄5X All- In- One RT MasterMix （with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）（美 國ABM 公司）。酶標儀（美國Bio-Rad公司）；顯微鏡（日本尼康公司）；核酸蛋白定量儀（北京凱奧公司）；電泳儀、電泳槽（北京市六一儀器廠）； 實時PCR儀（美國ABI公司）；凝膠成像系統（上海天能公司）。

1. 4結直腸癌炎癥微環境小鼠模型構建采用直腸癌細胞株接種法建立結直腸癌模型，再用LPS誘導腫瘤炎癥微環境[8]。方法：將小鼠固定于工作臺，以體積分數75%的酒精消毒右側腹背部皮膚，用注射器將0.1 mL 結直腸癌細胞（5 × 106個/mL）懸液緩慢注入小鼠背部右前方皮下，局部形成隆丘后退針，棉簽壓迫針孔以防細胞滲漏。以LPS 0.5 mg/kg一次性腹腔注射誘導腫瘤炎癥微環境。

1. 5分組與給藥造模成功后，將小鼠隨機分為模型組與中藥組，每組各12 只。中藥組小鼠給予白頭翁湯7.5 g·kg-1·d-1灌胃，模型組給予等體積生理鹽水灌胃。連續給藥21 d。

1. 6觀察指標與方法

1. 6. 1 聚合酶鏈反應陣列（PCR Array）檢測2組結直腸癌小鼠結直腸組織的差異基因 取結直腸組織，提取RNA，用核酸定量儀檢測RNA 濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。然后按照PCR Array試劑盒說明書操作。

1. 6. 2 實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）法檢測2 組結直腸組織中差異基因Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Cxcr3、Spp1 的表達 選取與結直腸癌最緊密的基因Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Cxcr3、Spp1，采用qRTPCR 法進行驗證。應用TRIzol 提取結直腸組織RNA，核酸蛋白定量儀檢測RNA 濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性。RNA 反轉錄為cDNA。進行PCR 擴增。PCR 反應條件：95 ℃2 min，1次；95 ℃5 s，60 ℃1 min，循環40 次。Ccr1 的上游引物為5’-CTCATGCAGCATAGGAGGCTT-3’，下游引物為5’-ACATGGCATCACCAAAAATCCA-3’，擴增片段142 bp。Cxcl1 的上游引物為5’-AC TGCACCCAAACCGAAGTC-3’，下游引物為5’-T GGGGACACCTTTTAGCATCTT-3’，擴增片段114 bp。Cxcl5 的上游引物為5’-GTTCCATCTCGCCAT TCATGC-3’，下游引物為5’-GCGGCTATGACTG AGGAAGG-3’，擴增片段103 bp。Cxcr3 的上游引物為5’-CTCTTTGCCCTCCCAGATTTC-3’，下游引物為5’-GGCATAGCAGTAGGCCATGAC-3’，擴增片段168 bp。Spp1的上游引物為5’-AGCAAGAAA CTCTTCCAAGCAA-3’，下游引物為5’-GTGAGA TTCGTCAGATTCATCCG- 3’， 擴 增 片 段134 bp。GAPDH的上游引物為5’-AGGTCGGTGTGAACGG ATTTG-3’，下游引物為5’-TGTAGACCATGTAGT TGAGGTCA-3’，擴增片段123 bp。

1. 6. 3 ELISA 法檢測血清IL-17、IL-23、TNF-α含量 取血清樣本， 嚴格按照IL- 17、 IL- 23、TNF-α試劑盒說明操作，用酶標儀于450 ～630 nm波長處測定吸光度（OD）值，以標準品濃度及對應的OD值繪制標準曲線，求得各細胞因子的含量。

1. 6. 4 qRT- PCR 法檢測結直腸組織JAK2、STAT3 mRNA 表達 操作方法同“1.6.2” 項。JAK2 的上游引物為5’-AAAGTGCGTTCGAGCGAA G-3’；下游引物為5’-TTCTGTCAGTGTCTCACTT TCC-3’，擴增片段301 bp。STAT3 的上游引物為5’-AGAACCTCCAGGACGACTTTG-3’，下游引物為5’-T CACAATGCTTCTCCGCATCT-3’，擴增片段159 bp。

1. 6. 5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測結直腸組 織JAK2 、 p-JAK2 、 STAT3 、 p-STAT3 蛋 白表達 取結直腸樣本加入蛋白裂解液，于冰上用超聲粉碎儀粉碎組織，放置冰上裂解30 min，于4 ℃12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，以二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。加上樣緩沖液，100 ℃加熱煮沸5 min 使蛋白變性。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將蛋白轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，經50 g/L 脫脂牛奶封閉2 h，一抗4 ℃過夜孵育，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，滴加電化學發光（ECL）顯色劑，自動凝膠成像系統曝光成像。采用Image Lab軟件測定其灰度值， 計算其相對表達量， 以GAPDH為內參。

1. 7統計方法采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行分析，計量數據均以均值± 標準差（x±s）表示。數據若符合正態分布，采用單因素方差分析方法；數據若不符合正態分布，先對數據進行對數轉化，使數據正態化，再按照上述單因素方差分析方法對數據進行統計。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 2組結直腸癌小鼠結直腸組織差異基因表1結果顯示：經PCR Array 檢測，2 組結直腸組織共有11 個炎癥相關差異基因：Ccl19、Ccl7、Ccr1、Cxcl1、 Cxcl5、 Cxcr3、 Il16、 Il1a、 Il1b、 Spp1、Tnfrsf11b。這些基因均和結直腸癌的發生與預后密切相關。提示白頭翁湯可能通過改善以上11 個基因發揮抗結直腸癌的作用。

表1 2組結直腸癌小鼠結直腸組織差異基因Table 1 Data of differential genes in colorectal tissue from mice with colorectal cancer in the two groups

2. 2 2組結腸癌小鼠結直腸組織Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Cxcr3、Spp1 mRNA表達水平比較鑒定Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Cxcr3、Spp1 以及內參基因GAPDH 的PCR 產物大小。圖1 結果顯示：Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Cxcr3、Spp1 基因的PCR 產物大小符合檢測基因的片段長度，且產物條帶單一。說明設計引物片段大小正確。圖2結果顯示：與模型組比較，中藥組結腸癌組織Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Spp1 mRNA 表達水平均顯著降低（P＜0.05），Cxcr3 mRNA表達水平無明顯變化（P＞0.05）。

2. 3 2組結直腸癌小鼠血清IL-17、IL-23、TNF-α含量比較圖3結果顯示：與模型組比較，中藥組小鼠血清IL-17、IL-23、TNF-α含量顯著降低（P＜0.01）。表明白頭翁湯可減輕結直腸癌炎癥反應。

2. 4 2組結直腸癌小鼠結直腸癌組織JAK2、STAT3 mRNA表達水平比較圖4結果顯示：與模型組比較， 中藥組結直腸癌小鼠結直腸組織JAK2、 STAT3 mRNA 表 達 水平 顯 著 降 低（P＜0.05）。表明白頭翁湯可能通過下調JAK2、STAT3 mRNA表達水平發揮抗腫瘤的作用。

圖1 PCR產物鑒定電泳圖Figure 1 Electrophoretogram of PCR product identification

圖2 2組結腸癌小鼠結直腸組織Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Cxcr3、Spp1 mRNA表達水平比較Figure 2 Comparison of mRNA expression levels of Ccr1，Cxcl1，Cxcl5，Cxcr3，Spp1 in colorectal tissue from mice with colorectal cancer in the two groups

圖3 2組結直腸癌小鼠血清IL-17、IL-23、TNF-α含量比較Figure 3 Comparison of contents of IL-17，IL-23，TNF-α in serum from mice with colorectal cancerin the two groups

圖4 2組結直腸癌小鼠結直腸癌組織JAK2、STAT3 mRNA表達水平比較Figure 4 Comparison of mRNA expression levels of JAK2 and STAT3 in colorectal tissue from mice with colorectal cancer in the two groups

圖5 2組結直腸癌小鼠結直腸癌組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平比較Figure 5 Comparison of the protein expression levels of JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3 in colorectal tissue from mice with colorectal cancer in the two groups

2. 5 2組結直腸癌小鼠結直腸組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平比較圖5 結果顯示： 與模型組比較， 中藥組JAK2、 p- JAK2、STAT3 表達水平差異均無統計學意義（P＞0.05），p-STAT3 表達水平顯著下調（P＜0.05）。表明白頭翁湯可通過下調p-STAT3 表達量，抑制JAK2-STAT3通路的激活，進而抑制炎癥，干預結直腸癌的發生與發展。

3 討論

結直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，具有惡性程度高、侵襲力強等特點，早期缺乏典型臨床癥狀，一旦確診往往處于疾病中晚期，預后不佳[9]。結直腸癌屬中醫 “腸積”“積聚”“癥瘕” 等范疇，多由正氣內虛、外感邪毒，亦或情志怫郁、飲食失節、素有舊疾等因素導致脾胃受損，水谷精微運化失司，以致水濕停滯體內，濕濁內生。濕濁下注于大腸，日久化生濁毒。濁毒壅滯腸道，日久化熱積聚成塊。因此，濕毒內蘊是結直腸癌的病機根本。白頭翁湯出自《傷寒論》，由白頭翁、黃連、黃柏、秦皮組成，具有清熱解毒、涼血止痢的功效。《醫方集解》曰，白頭翁湯中 “白頭翁苦寒能入陽明血分，而涼血止痢；秦皮苦寒性澀，能涼肝益腎而固下焦；黃連涼心清肝，黃柏瀉火補水，能燥濕止痢而厚腸，取寒能勝熱，苦能堅腎，澀能斷下也”。腹瀉、膿血便、里急后重、肛門灼熱、身熱、口渴、小便短黃是濕熱內蘊的常見臨床表現，這些均與炎癥反應密切相關。本課題組前期研究[3]顯示，炎癥反應和免疫應答的過度表達，約占到顯著性結直腸癌基因富集的62.5%。亦有研究[10-11]顯示，白頭翁湯具有較好的抗炎、抗腫瘤、抗菌、修復潰瘍、免疫調節等作用。

慢性炎癥的炎性微環境中，充斥大量的炎性細胞因子、趨化因子及前列腺素類物質，這些物質可以引起DNA 損壞以及抑癌基因的失活和癌基因的過表達，最終引起細胞的惡性轉化，形成腫瘤。本研究結果顯示：經PCR Array 檢測， 2 組小鼠結直腸組織共有11 個炎癥相關差異基因Ccl19、Ccl7、 Ccr1、 Cxcl1、 Cxcl5、 Cxcr3、 Il16、 Il1a、Il1b、Spp1、Tnfrsf11b。這些基因均與結直腸癌的發生和預后密切相關。提示白頭翁湯可能通過改善以上11 個基因發揮抗結直腸癌的作用。選取與結直腸癌最緊密的基因Ccr1、 Cxcl1、 Cxcl5l、Cxcr3、Spp1，采用qRT-PCR法進行驗證，結果顯示，與模型組比較，中藥組結腸癌組織Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Spp1 mRNA 表達水平均顯著降低（P ＜0.05），Cxcr3 mRNA表達水平無明顯變化。提示白頭翁湯可能通過改善Ccr1、Cxcl1、Cxcl5、Spp1等基因表達發揮抗結直腸癌的作用。

隨著腫瘤的發生以及炎性微環境的形成，腫瘤細胞生物學行為的產生和維持均依賴于STAT3活性。JAK2-STAT3通路是介導腫瘤炎癥微環境的關鍵信號通路，其中STAT3 作為慢性炎癥介導腫瘤發展的關鍵節點，可使慢性炎癥導致的腫瘤處于持續活化狀態。在慢性炎癥炎性微環境中，STAT3的激活調控一系列細胞因子（如TNF-α、IL-17、IL-23等）的表達[12-13]，維持著腫瘤炎性微環境，而腫瘤炎性微環境中的細胞因子又可進一步誘導STAT3持續性活化，進而形成 “炎癥-腫瘤” 的惡性循環。IL-23 可以介導STAT3 的磷酸化，激活STAT3，促進IL-17 的分泌[14]。IL-23 與其受體結合，引起JAK2 磷酸化，進一步促進STAT 的磷酸化，激活JAK-STAT通路。有研究顯示，在致癌物誘導的小鼠皮膚癌模型中，缺乏IL-17受體的動物表現出較低的腫瘤發生率或較小的腫瘤[15]。由于TNF-α 參與慢性炎癥性疾病，因此它是作為一種與炎癥介質相關的細胞因子參與其中的。TNF-α可以引起DNA損傷，從而促進腫瘤的發生。TNF-α介導的炎癥反應在很大程度上已與癌癥聯系起來[16]。本實驗進一步研究結果顯示：與模型組比較，中藥組血清IL-17、IL-23、TNF-α 含量降低，結直腸癌組織JAK2、STAT3 mRNA 表達降低，p-STAT3 蛋白表達降低。提示白頭翁湯可能是通過抑制IL-17、IL-23、TNF-α 等炎癥因子的分泌釋放，下調JAK2、STAT3 mRNA 和p-STAT3蛋白的表達，阻斷JAK2-STAT3通路的轉導，進而調控腫瘤炎癥微環境中炎性因子的表達從而發揮控制結直腸腫瘤的作用。

綜上所述，白頭翁湯可通過改變結直腸癌炎性微環境而起到抗腫瘤的作用。