外周血白細胞分化抗原195、雌二醇水平與橋本甲狀腺炎相關性研究*

程永紅,韓 梅,賈曉斌,劉 苗,劉 懿

1.陜西省商洛市中心醫院(商洛726000)；2.陜西省咸陽市涇陽縣醫院檢驗科(咸陽713700); 3.西安交通大學第一附屬醫院檢驗科(西安710061)

橋本甲狀腺炎(Hashimoto thyroiditis,HT)是臨床常見的自身免疫性疾病,其中女性呈現較高的發病率[1]。HT的發病機制目前尚不十分明確,目前的研究認為遺傳因素、環境因素以及免疫因素等的協同作用誘導了HT的發生[2]。研究證實HT與雌二醇之間存在明顯的相關性[3-4]。另外,白細胞分化抗原195(Cluster of differentiation 195,CD195)也被認為可能參與甲狀腺免疫活性紊亂的病理過程[5]。本研究通過分析HT患者血液雌二醇和 CD195與HT 的相關性,進而探討兩指標水平的變化對HT患者甲狀腺功能的影響。

資料與方法

1 一般資料 本研究選擇2018年3月至 2020年 3月期間80例于西安交通大學第一附屬醫院、陜西省商洛市中心醫院及陜西省咸陽市涇陽縣醫院就診的女性HT患者作為研究對象，依據HT患者的甲功檢查結果分為甲功正常組和甲功減退(甲減)組。正常組包括39例患者,平均年齡(50.79±5.23)歲,病程(3.16±2.96)年。甲減組包括41例患者,平均年齡(49.72±5.60)歲,病程(3.03±3.12)年。HT的診斷基于臨床、實驗室和影像學檢查結果[6]:血清甲狀腺球蛋白抗體和(或)甲狀腺過氧化物酶抗體(Thyroid peroxidase antibody,TPO-Ab)陽性；甲狀腺超聲檢查顯示甲狀腺彌散腫大。對照組選擇36例同期體檢健康人群，對照組納入標準：既往無其他自身免疫性疾病和其他內臟器官惡性腫瘤。各組研究對象的年齡及病程比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究已獲得西安交通大學第一附屬醫院、陜西省商洛市中心醫院及陜西省咸陽市涇陽縣醫院醫學倫理委員會批準,并得到所有研究對象的知情同意。

2 試劑和儀器 采用電化學發光免疫分析法測定血清雌二醇，游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3),游離甲狀腺素(FT4),促甲狀腺激素(TSH)及甲狀腺過氧化物酶抗體(TPO-Ab)水平，儀器和試劑分別使用美國貝克曼庫爾特Uni Cel DxI 800全自動免疫分析儀及其配套試劑盒。CD195陽性細胞百分比檢測應用直接免疫熒光技術，儀器采用美國BD公司的FACS Scan 流式細胞儀。人外周血淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司。RPMI1640細胞培養液購自杭州吉諾生物醫藥技術有限公司。異硫氰酸熒光素標記的鼠抗人CD195抗體購自深圳晶美生物工程有限公司，甲狀腺超聲檢查采用 Phlip IU22彩色超聲診斷儀。

3 研究方法

3.1 血樣采集：所有靜脈血樣在研究對象夜間禁食>8 h后的早晨(7:00～9:00)采集,共采集10 ml血液,分成兩管各5 ml,將一管血液樣本以 3000 r/min 離心后分離血清,進行雌二醇,TSH、FT3、FT4和TPO-Ab水平檢測或在-20 ℃下保存待用。另一管血液加入肝素抗凝用于檢測CD195陽性細胞百分比。

3.2 血液CD195陽性細胞百分比檢測：將肝素抗凝血液與磷酸鹽緩沖液以1∶1比例混合后置入圓底離心管中，并加入等體積的淋巴細胞分離液，以2000 r/min的速度離心15 min，然后收集有核細胞層，采用 Hank’s 液洗滌3次，每次以1500 r/min離心5 min。將洗滌后的細胞置入RPMI1640培養液中，調節細胞濃度為1×106/ml，再加入PHA ，調節質量濃度為100 μg/ml，放置于CO2培養箱孵箱48 h，要求穩定的溫度(37 ℃)和穩定的CO2水平(5%),然后收集CD195細胞，采用磷酸鹽緩沖液進行洗滌重懸，加入異硫氰酸熒光素標記的鼠抗人CD195，以不加抗體的標本作為陰性對照。 吹吸混勻后置于4 ℃孵育45 min，采用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，殘留液體吸盡，沉淀彈散后在各管中加入1% 多聚甲醛磷酸鹽緩沖液400 μl固定，于4℃保存，12 h 內應用 FACS Scan 流式細胞儀檢測CD195陽性細胞百分比。

3.3 甲狀腺超聲檢查：所有研究對象均行甲狀腺超聲檢查，由2名有4年甲狀腺超聲檢查經驗的醫師進行操作,使用高分辨率超聲波掃描儀,使用10 MHz線性探頭,測量甲狀腺的峽部厚徑。

結 果

1 各組甲狀腺功能及超聲檢查結果比較 HT患者甲狀腺呈現不同程度的腫大。與對照組比較，甲減組和正常組的峽部厚徑明顯增大,其中甲減組增大更顯著(P<0.01)。與對照組和正常組比較,甲減組血清FT3和FT4水平明顯降低,而TPO-Ab和TSH水平則明顯增高(P<0.01)。與對照組比較,正常組的TPO-Ab水平明顯增高(P<0.01),而TSH,FT3和FT4水平比較則無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組甲狀腺功能和超聲檢查結果比較

2 各組外周血雌二醇水平及CD195陽性細胞百分比比較 與對照組比較,甲減組和正常組的雌二醇水平和CD195陽性細胞百分比均明顯增高(P<0.01),甲減組的兩指標與正常組比較明顯增高(P<0.01),見表2。

表2 各組外周血雌二醇及CD195水平比較

3 相關性分析 甲減組和正常組的雌二醇水平和CD195陽性細胞百分比呈正相關性(r=0.823,P<0.01)。甲減組雌激素水平和CD195陽性細胞百分比分別與TSH,TPO-Ab及峽部厚徑呈正相關性,而與FT3和FT4水平呈負相關性[r(雌二醇)=0.838,0.810,0.817,-0.799,-0.803,均P<0.01;r(CD195)=0.824,0.809,0.782,-0.804,-0.829,均P<0.01]。正常組的雌激素水平和CD195陽性細胞百分比分別與TSH,TPO-Ab水平及峽部厚徑有正相關性[r(雌二醇)=0.786,0.821,0.808,均P<0.01;r(CD195)=0.771,0.789,0.802,均P<0.01]。

討 論

HT是自身免疫性甲狀腺疾病中最常見的一種，發病率高達5%，發病人群主要是育齡婦女。HT患者甲狀腺腫大，甲狀腺內單核細胞明顯浸潤，血清抗甲狀腺自身抗體濃度升高，包括抗甲狀腺球蛋白抗體和TPO-Ab，是導致甲狀腺功能減退的最常見的潛在因素[6-7]。本研究的結果則印證了上述文獻的觀點，其中甲減組TPO-Ab水平增高更顯著，該組患者的甲狀腺腫大更明顯。研究指出,甲狀腺局部的T淋巴細胞免疫功能紊亂誘導了HT的發生，CD4+T淋巴細胞分泌的Th1/Th2 細胞的比例失衡是導致橋本甲狀腺炎發病的重要機制之一。在橋本甲狀腺炎的發病過程中Th1細胞的表達明顯占優勢[8]。Th1 細胞分泌IL-2，IFN-γ和TNF-α 等細胞因子。這些細胞因子誘導B細胞分化并分泌過量自身抗體，同時趨化大量T淋巴細胞和單核細胞進入甲狀腺細胞內發揮細胞毒性作用，最終導致甲狀腺細胞的損傷[9]。CD195是CD4+T淋巴細胞特異性的表面因子。單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞中均發現有CD195表達。研究發現CD195是Th1細胞的優勢細胞因子[10]。CD195的過度表達誘導Th1細胞的細胞毒作用導致甲狀腺細胞損傷,是引起HT患者甲狀腺功能減退的主要原因[11]。李存杰等[12]的研究發現HT患者經過治療后CD195及TPOAb水平明顯下降。袁曉嵐等[10]的研究認為HT患者外周血液的CD195陽性細胞百分比明顯高于對照組。經過治療后甲減組和甲功能正常組CD195陽性細胞百分比顯著降低。他們進一步地研究認為CD195與TSH及TPOAb有明顯相關性。本研究結果與上述文獻的觀點相符。提示CD195可能參與HT細胞免疫紊亂的病理過程,其異常表達可能誘導了HT的發生。

目前，自身免疫性疾病的發病率呈上升趨勢，其影響著5%～8%的人口[13]。研究表明女性最容易發生自身免疫性疾病,其對該疾病具有較高的細胞免疫敏感性。近年來的研究發現雌激素參與了人體的免疫調節機制，從而有可能影響到甲狀腺的功能，并與 HT 的發生及發展有一定的相關性[14]。雌激素屬于類固醇激素,其生物學作用主要通過調控核內雌激素受體完成。人體多個組織器官中都被發現有雌激素受體表達,包括女性生殖器官乳腺和子宮以及腎臟、骨骼和男性生殖器官等[15]。文獻報道甲狀腺組織細胞中也存在雌激素受體表達[16]。雌激素通過作用于T細胞上的雌激素受體促進T細胞的增殖和活化以及細胞因子的釋放，并導致Th1/Th2的比例失衡，進一步引起T細胞功能的紊亂，并激活B細胞產生更多的自身抗體，進而誘導HT的發生[17]。研究發現HT患者甲狀腺細胞中的雌激素受體陽性率明顯高于對照組[18]。另外，圍絕經期HT患者體內雌二醇水平也被發現明顯增高[14]。提示雌激素水平的變化與HT的發生存在相關性。本研究對HT患者的分析與上述文獻的結論相符。提示雌激素可能與HT患者的免疫功能紊亂有關,雌二醇水平的變化可能影響著HT的發生和發展。然而雌激素與HT相關性的深層機制有待進一步研究，同時需要更多的樣本量進行分析印證。

本研究相關性分析的結果顯示甲減組和正常組的雌二醇水平和CD195陽性細胞百分比有正相關性。甲減組的雌二醇水平和CD195陽性細胞百分比分別與TSH、TPO-Ab、FT3和FT4水平有顯著相關性。目前,彩色多普勒超聲檢查廣泛應用于HT疾病的診治中,其可提高HT診斷的敏感性和特異性[19]。本研究結果顯示HT患者的峽部厚徑明顯增大,其中甲減組增大更顯著。進一步地分析顯示甲減組的雌二醇水平和CD195陽性細胞百分比分別與甲狀腺峽部厚徑有正相關性,推測雌二醇和CD195可能與HT患者甲狀腺局部的免疫紊亂有關，其異常的表達可能誘導了HT的發生。