染色體微陣列分析技術在先天性心臟病胎兒產前遺傳學診斷中的應用價值*

馬 威,魏 波,張慧萍

寧夏醫科大學總醫院產前診斷中心(銀川750004)

先天性心臟病(Congenital heart disease,CHD)是目前最常見的出生缺陷疾病，占各種主要先天性疾病的1/3左右[1-2]。CHD是導致新生兒非感染性死亡的重要原因之一，盡管隨著心臟外科技術的不斷發展，大部分CHD經手術可獲得良好的治療效果。但在一些遺傳綜合征，CHD僅作為其表型之一，即使外科手術可以糾正心臟解剖異常，但患者術后仍無法獲得滿意的生活質量[3]。因此，通過遺傳學診斷，了解CHD的遺傳學病因具有重要的臨床意義。染色體微陣列分析(Chromosome microarray analysis,CMA)技術是一種高分辨率、高通量并且可以在全基因組水平檢測染色體不平衡拷貝數變異(Copy number variation,CNV)的技術[4-5]。目前CMA以其高分辨率的檢測能力被迅速地應用于產前遺傳診斷，本研究通過應用高分辨率基因芯片對76例CHD胎兒進行全基因組分析，以探討CMA在CHD胎兒產前遺傳診斷中的應用價值。

資料與方法

1 一般資料 選取2018年4月至2019年12月就診于寧夏醫科大學總醫院產前診斷中心的孕婦76例。病例納入標準：均經超聲提示CHD胎兒;均為單胎妊娠;均進行產前遺傳咨詢并自愿進行侵入性產前診斷(核型分析+CMA檢測);本研究取得患者知情同意并簽署知情同意書。排除標準：有病毒感染史或明顯致畸物質接觸史者;只進行常規染色體核型分析或CMA檢測之一者。根據上述標準共納入76例孕婦，年齡21～36歲，平均(29.14±7.20)歲；孕周17～28周，平均(22.58±5.93)周。

2 研究方法

2.1 超聲檢查：采用飛利浦IU22、GEE8超聲儀，探頭頻率2.5～6 MHz,所有孕婦常規進行超聲檢查，懷疑胎兒患有CHD時，對孕婦進行胎兒超聲心動圖檢查，按照胎兒心臟檢查標準規范進行系統掃查。

2.2 樣本采集：對孕周17～28周的孕婦行超聲定位下羊膜腔穿刺術，抽取羊水25～30 ml，其中20 ml用于細胞培養染色體核型分析，其余5～10 ml用于CMA檢測。對孕周24周以上的孕婦在超聲引導下抽取臍帶血3 ml，其中1.5 ml用于細胞培養及染色體核型分析，其余1.5 ml用于CMA檢測。

2.3 染色體制片及核型分析：于無菌操作條件下將抽取的羊水或臍血加入到無菌離心管內，離心收集羊水或臍血細胞，采用貼壁細胞培養法培養10～14 d，見細胞生長良好加入秋水仙堿，收集羊水或臍血細胞，常規制片，G顯帶后玻片置于GSL-120自動染色體掃描儀進行掃描分析。

2.4 CMA檢測：采集的羊水或臍血樣本均采用DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)提取基因組DNA。根據Cyto Scan HD芯片(美國Affymetrix公司)檢測流程，依次進行基因組DNA消化、連接、擴增、純化、片段化、標記、雜交、洗滌及掃描，應用ChAS軟件進行數據分析。1 M芯片所檢測到的>1 kb的片段缺失或重復，定義為CNV，結果判讀參照DGV、ISCA、OMIM、ECIPHER等數據庫。

3 統計學方法 使用SPSS 20.0統計學軟件進行數據統計分析，計數資料采用率表示，用χ2檢驗；所有檢驗均采取雙側檢驗，檢驗水平α=0.05。

結 果

1 76例CHD胎兒超聲檢查情況 76例CHD胎兒超聲提示的心臟畸形包括：房(室)間隔缺損、主動脈縮窄、肺動脈閉鎖、三尖瓣異常、永存左上腔靜脈、心內膜墊缺失、心包積液、法洛四聯癥。其中單一心臟畸形、多發心臟畸形和合并心外畸形的比例見表1。

表1 76例胎兒CHD表型分類

2 染色體核型分析結果 76例CHD胎兒共檢出11例(14.47%)染色體核型異常，其中21-三體綜合征3例，18-三體綜合征4例，標記染色體(47,XY,+mar)2例，臂間倒位[46,XY,inv(9)(p11q13)]1例，平衡易位[46，XX,t(3；7)(p21；q23)]1例。

3 CMA檢測結果 76例CHD胎兒受檢樣本CMA共檢出15例(19.74%)異常，均為已知的致病性異常，其分布情況見表2。

表2 CMA檢測異常情況

4 CMA檢測結果與染色體核型分析結果比較 CMA和染色體核型分析對不同心臟畸形CHD胎兒致病性異常檢出率比較均無統計學差異(P>0.05)，見表3。染色體核型分析致病性異常的檢出率為14.47%,CMA致病性異常的檢出率為19.74%,相較染色體核型分析，CMA能夠將致病性異常的檢出率提高5.26%(4/76)，但兩者比較差異無統計學意義。CMA對合并心外畸形組致病性CNV檢出率顯著高于單一心臟畸形組(χ2=0.610，P=0.017)。

表3 CMA檢測結果與染色體核型分析致病性異常檢出情況比較 [%(例)]

討 論

臨床常見的CHD包括房室間隔缺損、永存左上腔靜脈、心包積液、肺動脈狹窄、法洛四聯癥、動脈導管未閉、二尖瓣閉鎖不全、三尖瓣反流、血管環等[6]。是目前最常見的先天畸形，也是目前嬰幼兒死亡的首要原因。CHD的發病原因尚不明確，目前的觀點主要認為是遺傳因素、環境因素及兩者共同作用有關[7-8]。有研究表明，約40% CHD是由遺傳因素導致的，主要包括染色體畸變、單基因病、多基因遺傳缺陷等。通過運用超聲檢查可發現胎兒心臟發育異常以及有可能提示胎兒異常的“軟指標”，進而提示胎兒染色體變異[9]。出生缺陷的防治應以預防為主，產前超聲篩查胎兒心臟結構畸形，進而應用細胞遺傳學及分子遺傳學診斷胎兒的病因及發病機制，有助于完善圍產期監測和診療措施，改善先心病患兒的預后，降低病死率。

目前胎兒染色體核型分析技術仍然是產前細胞學診斷的金標準，盡管G顯帶核型分析分辨率不斷提升，但對于5 Mb及以下的微缺失和微重復，染色體核型分析仍無法檢出。CMA技術又被稱為“分子核型分析”，據探針類型不同可將CMA分為基于微陣列的比較基因組雜交(aCGH)技術和單核苷酸多態性微陣列(SNP array)技術，CMA能夠在全基因組水平進行掃描，可檢測亞顯微水平的缺失和重復，即CNV[9-10]。有研究[11-12]指出，在一些伴有明顯異常超聲表現的胎兒，其染色體核型分析結果并無異常，但CMA可以發現約10%具有臨床意義的CNV。

本研究中所采用SNP array技術平臺，應用CytoScan 750K芯片，能準確檢測出100 kb以上CNV。本研究中收集的76例CHD胎兒羊水、臍血樣本，采用CMA技術檢測均獲得檢測結果，而在染色體核型分析過程中，2例(2.63%)因細胞培養失敗未獲得檢測結果，染色體核型分析需要經過羊水、臍血細胞培養，存在培養失敗的風險，而CMA則無需這一步驟。本研究中CMA共檢出15例(19.74%)異常，且均為已知的致病性異常，Zhu等[13]在115例CHD胎兒中檢出21例(18.26%)的致病性CNV，和本研究較為接近。本研究中CMA未發現假陽性結果，相比染色體核型分析能夠將致病性異常的檢出率提高5.26%(4/76)。田雨等[14]研究中CMA將染色體異常檢出率提高了3.53%，略低于本研究結果，考慮與不同研究樣本構成差異及檢驗人員操作因素相關。在染色體核型分析檢出的11例異常胎兒中，除外21-三體綜合征3例和18-三體綜合征4例，余4例CHD胎兒經染色體核型分析均無法對其致病性及臨床預后進行綜合判斷，而CMA則能明確染色體來源、片段大小及其致病性[15]。本研究中2例額外小標記染色體均經CMA確診為22q11.1微重復1例，1例平衡易位經CMA檢測為致病性亞顯微結構缺失。由此可見，CMA技術能彌補染色體核型分析在染色體亞顯微改變檢測方面的不足，對遺傳咨詢中CHD胎兒預后的評估更為有利。本次研究中，合并心外畸形組致病性CNV檢出率(31.82%，7/22)顯著高于單一心臟結構畸形組(6.67%，2/30)，提示對于合并心外畸形的CHD胎兒CMA檢測尤為必要。

綜上所述，CMA在CHD胎兒遺傳學診斷中具有重要的應用價值，相較于核型分析，該技術能夠將遺傳學病因檢出率額外提高5.26%，對于核型分析正常的CHD胎兒進一步行CMA檢測有助于正確評估胎兒預后。