G蛋白信號轉導調節因子通過抑制MAPK和NF-κB通路緩解脂多糖誘導的人膝骨關節軟骨細胞炎癥反應實驗研究*

趙 宇，李 洺，趙 江，董炳辰，馬 丁

1.西安市第九醫院骨科(西安 710054)；2.西安市第九醫院老年病科(西安 710054)

骨性關節炎(Osteoarthritis,OA)是一種退行性疾病，年齡是誘發OA最重要的誘因[1]。OA的特征是關節的逐漸退化，導致關節活動能力和功能喪失，并伴有慢性疼痛[2]。近年來，隨著對OA發病機制的深入探究，人們發現軟骨細胞炎癥損傷在OA疾病的進展中具有重要作用，并且軟骨細胞炎癥損傷的研究對了解OA的治療具有重要意義[3]。RGS1是G蛋白耦聯受體(G protein-coupled receptor，GPCR)的調節因子，負調控GPCR，從而影響下游的細胞通路[4]。RGS1參與了絕大多數炎癥反應，并在免疫細胞包括B淋巴細胞、T淋巴細胞、樹突狀細胞和單核細胞中強烈表達[5-6]。研究發現RGS1在類風濕關節炎和未分化型脊椎關節炎中具有重要作用[7-8]。在之前的一項研究報道RGS1在膝關節骨性關節炎(Knee osteoarthritis,KOA)的軟骨中表達水平高于正常軟骨細胞[9]，然而，RGS1在KOA疾病中的具體功能鮮少研究。本文主要探討RGS1對脂多糖(LPS)刺激介導的人KOA軟骨細胞炎癥的影響和潛在的機制，以期為KOA的治療提供一定的理論依據。

材料與方法

1 主要試劑 LPS(L6529-1MG，Sigma，美國)；正常人膝關節軟骨細胞(NHAC-kn，CC-2550，Lonza Walkersville，美國)；胎牛血清(SV30087.02)、DEME(C11885500BT，Gibco，美國)，Trizol試劑(15596018，Invitrogen，美國)；細胞計數試劑盒(CCK-8，DJDB4000X，Dojindo Molecular Technologies，日本)；基質金屬蛋白酶(MMP)-2 ELISA試劑盒(MMP200)、MMP-9 ELISA試劑盒(DMP900，R&D Systems，美國)；RNA反轉錄試劑盒與cDNA合成試劑盒(RR047A)、qPCR定量試劑盒(DRR820A，Takara，日本)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(P0012A，碧云天生物技術，中國)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(GVWP04700，Millipore，美國)；抗RGS1抗體(ab154973)、抗一氧化氮合酶(i-NOS)抗體(ab178945)、抗環氧化酶(COX-2)抗體(ab16701)、抗p-ERK1/2抗體(ab214036)、抗ERK1/2抗體(ab54230))、抗p-p38抗體(ab38238)、抗p38抗體(ab31828)、抗p-JNK抗體(ab76572)、抗JNK抗體(ab179461)、抗NF-κB p-p65抗體(ab194726)和抗NF-κB p65抗體(ab16502，Abcam，英國)；抗GADPH抗體(ab8245)、辣根過氧化物酶(HRP)二抗(9003-99-0，美國Sigma公司)；Lipofectamine 3000(L3000-015，Invitrogen，美國)。

2 研究方法

2.1 人膝關節軟骨細胞培養：NHAC-kn細胞培養于含10%胎牛血清的DEME培養基中，將培養基置于含5% CO2培養箱中培養，培養箱溫度為37℃。

2.2 LPS刺激和細胞活性檢測：NHAC-kn細胞接種于24孔板(1×105/孔)。待軟骨細胞長至80%融合后，不同濃度的LPS(10、100、500、1000 ng/ml)分別處理軟骨細胞。此外，空白對照軟骨細胞不做任何處理。6 h后，CCK-8檢測細胞活性。

2.3 細胞轉染：RGS1-shRNA1和RGS1-shRNA2及其陰性對照組合成于上海吉瑪制藥技術有限公司。Lipofectamine 3000轉染試劑盒將這些載體轉染入軟骨細胞。

2.4 RT-qPCR：未處理組、LPS、LPS+shRNA、LPS+shRGS1 NHAC-kn細胞接種于96孔板，于37℃培養24 h。隨后，收集各組細胞，Trizol 法用于分離RNA，檢測RNA濃度和片段的完整性。取2 μg總RNA進行反轉錄實驗，然后NHAC-kn細胞RGS1、TNF-α、IL-1β、MMP-2和MMP-9轉錄水平根據qPCR試劑盒說明書進行檢測。GADPH作為內參基因。2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

2.5 Western blot：未處理組、LPS、LPS+shRNA、LPS+shRGS1細胞接種于96孔板，于37℃培養24 h。收集并裂解細胞，BCA法用于檢測蛋白的總濃度，12% SDS-PAGE凝膠分離蛋白并轉移到PVDF膜上，室溫封閉3 h。初抗抗體RGS1、i-NOS、COX-2、p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38、p38、p-JNK、JNK、NF-κB p-p65、NF-κB p65和GADPH低溫下孵育過夜。隨后，室溫下用HRP二抗孵育1 h。

2.6 ELISA檢測：未處理組、LPS、LPS+shRNA、LPS+shRGS1細胞均勻接種于96孔板，37℃條件下培養24 h。培養液中NO水平采用NO定量ELISA試劑盒檢測；MMP-2和MMP-9水平分別使用MMP-2 ELISA試劑盒和MMP-9 ELISA試劑盒。

3 統計學方法 使用SPSS 22.0統計學軟件進行統計學分析。三個獨立實驗的所有結果均顯示為平均值±標準差。采用t檢驗評價兩組間的統計學差異，單因素方差分析(One-way ANOVA)用于兩組以上比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 LPS處理促使NHAC-kn細胞中RGS1水平升高 首先，將軟骨細胞與LPS孵育，誘導細胞損傷。實驗結果表明，100、500、1000 ng/ml LSP處理軟骨細胞6 h可以顯著降低細胞活性(P<0.05，圖1A)。另外，LPS可以誘導RGS1 mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05，圖1B)。因此，在后續的實驗中選擇100 ng/ml LPS誘導體外軟骨細胞損傷。

圖1 LPS對軟骨細胞活性和RGS1 mRNA表達的影響

2 抑制RGS1減輕LPS介導的NHAC-kn細胞炎癥 為了研究RGS1對LPS刺激引發的軟骨細胞炎癥的作用，實驗選擇兩個特異性的干擾質粒轉染NHAC-kn細胞。結果表明，RGS1-shRNA1和RGS1-shRNA2均可使RGS1轉錄水平顯著下調，并且RGS1-shRNA1的沉默效率高于RGS1-shRNA2(P<0.05，圖2A)。因此，后續實驗選用RGS1-shRNA1作為干擾片段。LSP處理6 h顯著提高NO含量、i-NOS和COX-2蛋白水平，以及TNF-α和IL-1β轉錄水平；然而RGS1沉默顯著緩解了由LPS誘導的NO含量，i-NOS和COX-2蛋白水平以及TNF-α和IL-1β轉錄水平的升高(P<0.05，圖2B～F)。

3 RGS1-shRNA減弱LPS誘導的MMP-2和MMP-9表達量 見圖3，LPS和LPS+shRNA兩組中MMP-2和MMP-9水平均顯著高于未處理組，而LPS+shRGS1組MMP-2和MMP-9水平顯著低于LPS+shRNA組(P<0.05，圖3A～D)。

4 RGS1-shRNA抑制MAPK和NF-κB信號的激活 本研究中，為了進一步研究沉默RGS1對LPS介導軟骨細胞炎癥的緩解作用的潛在機制，我們選擇了MAPK和NF-κB兩個炎癥相關的信號通路進行研究。結果表明抑制RGS1表達可顯著緩解由LPS誘導的p-ERK1/2和NF-κB p-p65磷酸化水平上調(P<0.05，圖4A、D)，然而抑制RGS1對LPS誘導的p-p38和p-JNK磷酸化水平的升高無顯著影響(P>0.05，圖4B、C)。

圖2 RGS1敲除對軟骨細胞炎癥反應的影響

討 論

本實驗探究了RGS1在LPS刺激引發的軟骨細胞炎癥損傷中的效果和可能的機制。實驗結果發現LPS(100，500和1000 ng/ml)處理軟骨細胞可有效地抑制細胞活性，表明LPS能有效地誘導炎性損傷關節軟骨細胞的體外模型。此外，LPS處理軟骨細胞可以改變細胞中RGS1的表達量，且其表達量的變化與LPS處理的濃度有關，這與Riekenberg等的研究發現LPS刺激誘導巨噬細胞RGS1的表達量變化是濃度依賴性的結果相似[10]。因此，我們選用100 ng/ml LPS作為體外誘導軟骨細胞炎癥反應的濃度。

越來越多的證據指出，細胞因子和炎性介質在骨關節炎的發生發展病理過程中扮演著重要的角色，其中炎性介質NO和細胞因子IL-1β和TNF-α為主[11]。有學者研究表明，NO能夠抑制蛋白多糖和膠原蛋白的合成，促進軟骨細胞凋亡，介導IL-1β和TNF-α參與調節骨關節炎的發生發展[12]。骨關節炎中NO的產生主要由i-NOS來決定[13]。LPS能夠刺激軟骨細胞i-NOS的表達以及NO的產生，和各種細胞因子如IL-1β共同增加對軟骨細胞的傷害[14]。

圖4 RGS1敲除對軟骨細胞MAPK和NF-κB通路蛋白表達的影響

Xu等[7]在類風濕性關節炎中的研究發現，RGS1沉默可抑制炎癥反應和血管生產。TNF-α和IL-17誘導的RGS1高度抑制脊柱關節炎的分化[8]。在本研究中，RGS1敲除可以緩解LPS誘導上調的NO含量和i-NOS和COX-2蛋白表達以及細胞因子IL-1β和TNF-α表達水平。

軟骨退變在骨關節炎的發生發展中起著重要作用。正常關節中軟骨基質的合成和降解是動態平衡的。研究發現，MMPs的過量表達致使關節軟骨合成與代謝的失衡，導致軟骨細胞外基質分解多于合成，因此提高關節軟骨退變的速度[15-16]。MMP-2和MMP-9可以誘導軟骨基質成分的分解，在骨性關節炎相關的軟骨降解中起關鍵作用。我們發現RGS1沉默可以顯著抑制的MMP-2和MMP-9蛋白表達。這與Hu等研究發現RGS1缺失的類風濕性關節炎小鼠MMP-2和MMP-9蛋白表達顯著下降的結果相一致[7]。

MAPK和NF-κB通路在軟骨細胞炎癥，軟骨退化和基質金屬蛋白酶調節中發揮著重要作用[17-18]。研究發現，RGS1是許多信號通路的上游效應器包括MAPK信號通路，其主要是通過調節Ga蛋白水平影響信號通路[19]。我們發現沉默RGS1抑制LPS誘導的ERK的磷酸化，但是對p38和JNK的磷酸化卻沒有抑制作用。Sun等[20]在黑色素瘤中的研究發現RGS1過表達明顯促進了ERK的磷酸化，并且RGS1沉默顯著降低了EKR的磷酸化水平。此外，Patel等研究發現在小鼠血管平滑肌細胞系中轉染RGS1對p38和JNK的磷酸化不起作用[19]。在靜止狀態下，p65與其抑制因子IκB一起存在于細胞質中。當受到炎癥因子刺激LPS，p65磷酸化水平增加并從細胞質轉移到細胞核。隨后p56促進炎性基因的表達如MMPs，i-NOS和COX-2。本研究結果發現RGS1敲除可抑制NF-κB通路，這與劉星等在小鼠巨噬細胞RAW264.7上的研究結果一致[21]。因此，RGS1缺失抑制LPS誘導的軟骨細胞炎癥的機制可能是RGS1沉默抑制了ERK和NF-κB信號通路。

綜上所述，沉默RGS1減輕LPS刺激介導的軟骨細胞炎癥損傷，延緩關節軟骨退變。其機制可能是沉默RGS1抑制ERK和NF-κB通路的活化。因此，本研究的發現可以為OA的治療提供理論基礎。