核因子-κB信號通路對肺炎模型小鼠免疫功能和炎癥反應的影響

郭 黎，王 靜

1.陜西省安康市中心醫院(安康 725000);2.陜西省楊凌示范區醫院(楊凌 712100)

肺炎是臨床常見呼吸系統疾病，通常是由于環境異物及細菌、病毒等感染導致的氣道、肺泡及肺間質炎癥反應[1-2]。兒童則因其身體、生理及免疫功能等發育未成熟，因此對病原體抵抗力較弱，從而成為肺炎的高發人群。相關研究顯示：小兒肺炎病情發展迅速，若未得到及時治療，容易發展為小兒重癥肺炎，并引發呼吸衰竭等一系列并發癥，對患兒的健康及生命具有嚴重威脅[3-4]。核因子-κB(Factor-kappa B,NF-κB)是細胞中重要的轉錄調節因子，正常條件下以二聚體形式存在而非活化狀態，相關研究顯示：該通路激活與細胞周期進程、炎癥反應以及多種疾病發生進展密切相關[5-7]。鑒于此，本研究采用肺炎鏈球菌誘導肺炎小鼠模型，并通過NF-κB通路抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(1-Pyrrolidinecarbodithioic acid，PDTC)對模型進行干預，從而進一步探討NF-κB信號通路對肺炎模型小鼠免疫功能和炎癥反應的影響，為該疾病的臨床治療提供實驗基礎。

材料與方法

1 實驗材料 選取24只SPF級雄性BALB/c小鼠(由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供)，體重(28±2)g，常規飼養2周后造模。肺炎鏈球菌菌株購自廣東微生物菌種保藏中心。NF-κB通路抑制劑PDTC購自上海一研生物科技有限公司。

2 分組及肺炎模型建立 將24只小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組和模型+PDTC組，每組8只。其中模型對照組和模型+PDTC組小鼠麻醉后，根據張輝果等[8]相關研究方法建立肺炎小鼠模型，具體如下：采用無菌針頭刺破小鼠鼻黏膜，從鼻腔滴入6×108CFU/ml肺炎鏈球菌D39標準菌株溶液，每只0.1 ml，連續接種3 d，經前期預實驗行肺組織病理切片證實模型成功。正常對照組小鼠麻醉后，刺破鼻黏膜，從鼻腔滴入等量生理鹽水。

3 干預方法 造模3 d后模型+PDTC組小鼠腹腔注射NF-κB通路抑制劑PDTC，劑量120 mg/kg。正常對照組和模型對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。三組均連續注射2周。

4 檢測指標 連續注射2 周后，各組小鼠麻醉后斷頸法處死，分別采集三組小鼠腹主動脈血，室溫下離心取血清，保存待檢；最后取小鼠完整肺組織，保存待檢。

4.1 肺組織含水量及干濕比檢測[9]：取各組小鼠右肺上葉組織，生理鹽水沖洗并用吸水紙吸干后稱重，即為濕重(W)，然后將肺組織置于80℃烤箱中持續烘烤24 h進行再次稱重，即為干重(D)，計算含水量(TLW)和干濕比(D/W)[TLW=(W-D)/D×100%；D/W=D/W×100%]。

4.2 肺組織NF-κB蛋白表達檢測：干預結束后，取適量小鼠左肺組織，總蛋白提取試劑盒(購自上海碧云天生物技術有限公司)提取肺組織總蛋白，BCA法進行蛋白定量，然后上樣，進行SDS-PAGE電泳(100 V90 min)，轉膜、染色、封閉、加一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜后曝光、觀察并拍照，圖像分析軟件獲取各組小鼠肺組織NF-κB蛋白表達的條帶灰度值。

4.3 外周血T淋巴細胞亞群檢測：干預結束后，取三組待檢靜脈血，流式細胞儀檢測各組小鼠外周血中T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+占比。

4.4 血清炎性反應指標檢測：干預結束后，取三組小鼠待檢血清，分別采用小鼠ELISA試劑盒(購自上海碧云天生物技術有限公司)檢測三組小鼠血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-10(IL-10)的含量，具體過程按照試劑盒說明書進行操作。

結 果

1 三組小鼠肺組織含水量及干濕比比較 與正常對照組相比，模型對照組肺組織TLW顯著增加，而D/W比值顯著降低(P<0.05)；與模型對照組相比，模型+PDTC組小鼠肺組織TLW顯著降低，D/W比值顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 三組小鼠肺組織含水量及干濕比比較(%)

2 三組小鼠肺組織NF-κB蛋白表達比較 與正常對照組相比，模型對照組肺組織NF-κB蛋白相對表達量顯著增加(P<0.05)；與模型對照組相比，模型+PDTC組小鼠肺組織NF-κB蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 三組小鼠肺組織NF-κB蛋白相對表達量比較(灰度值)

3 三組小鼠外周血T淋巴細胞亞群檢測結果比較 與正常對照組相比，模型對照組小鼠外周血CD3+和CD4+百分比以及CD4+/CD8+比值均顯著減小(P<0.05)；而與模型對照組相比，模型+PDTC組小鼠以上指標占比或比值均顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 三組小鼠外周血T淋巴細胞亞群檢測結果比較

4 三組小鼠血清炎性反應水平比較 與正常對照組相比，模型對照組小鼠血清促炎因子TNF-α和IL-6含量均顯著升高，抗炎因子IL-10含量顯著降低(P<0.05)；而與模型對照組相比，模型+PDTC組小鼠血清中TNF-α和IL-6含量均顯著降低，而IL-10含量顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 三組小鼠血清炎性反應水平比較(pg/ml)

討 論

肺炎是嬰幼兒時期的呼吸道多發病，根據其致病原因可分為細菌性、病毒性、支原體及衣原體肺炎等，該病常見臨床特征為：呼吸急促、困難、咳嗽發熱、肺啰音等[3,10]。除根據臨床特征進行初步診斷外，該疾病常通過血清學指標檢測、微生物培養檢測以及抗體檢測等進行確診[11-12]。目前肺炎常用治療手段主要包括中西醫藥物治療、霧化吸入治療以及藥物霧化聯合治療等，均取得了一定治療效果[10-13]。但由于病情發展迅速，若未得到及時治療，容易發展為重癥肺炎，然而該進展過程的具體原因及機制仍需進一步研究。

NF-κB被稱為早期基因表達的開關，是一種分布于細胞漿中以p50/p65異二聚體形式存在的反轉錄因子，一般與其抑制性蛋白(Inhibitor kappa B,IκB)結合而呈非活性狀態，大量研究結果表明：NF-κB信號通路參與多種細胞損傷、凋亡、病理以及惡性腫瘤細胞侵襲和遷徙等相關過程及反應，可被以上過程的相關因子刺激而激活從而介導或調控機體免疫應答[14]。本研究通過NF-κB通路抑制劑PDTC對肺炎模型小鼠進行干預，結果表明：與正常對照組相比，炎癥模型小鼠肺組織TLW顯著增加，而D/W比值顯著降低;與模型對照組相比，PDTC干預后小鼠肺組織TLW顯著降低，D/W比值顯著增加,表明肺炎小鼠的肺組織病理狀態較差，而PDTC干預后肺組織水腫程度顯著改善。與正常對照組相比，模型對照組肺組織NF-κB蛋白相對表達量顯著增加;與模型對照組相比，PDTC干預后小鼠肺組織NF-κB蛋白相對表達量顯著降低,表明肺炎發生后，肺組織中NF-κB被激活，因此其表達量顯著上升，而PDTC干預后，肺炎小鼠肺組織中NF-κB通路受到抑制。

相關研究提出：肺炎病情進展過程中會引發多器官損害的并發癥，對患兒生命健康和生長發育均有嚴重威脅，因此明確病原菌感染后患兒免疫功能以及相關病理反應的變化規律及機制對其治療具有重要意義[15]。本研究中，與正常對照組相比，模型對照組小鼠外周血T淋巴細胞亞群CD3+和CD4+百分比、CD4+/CD8+比值以及抗炎因子IL-10含量均顯著降低；而促炎因子TNF-α和IL-6含量均顯著升高,表明肺炎發生后，患兒免疫功能受到影響而減弱，且炎癥反應水平升高；而與模型對照組相比，肺炎模型+PDTC組小鼠外周血T淋巴細胞亞群CD3+和CD4+百分比、CD4+/CD8+比值以及抗炎因子IL-10含量均顯著升高，而促炎因子TNF-α和IL-6含量均顯著降低，表明PDTC干預后，小鼠免疫功能相關T淋巴細胞亞群以及炎癥反應水平相關指標均顯著改善，結合前文結果，肺炎的發病機制可能與NF-κB信號通路激活有關，而通過抑制該通路可顯著改善肺炎小鼠肺組織病理狀態，增強其免疫功能，并改善其炎癥反應水平。另外，本研究存在不足之處：研究周期較短，并未對免疫功能和炎癥反應的變化趨勢進行深入分析，將在后續延長實驗時間進行探討。