絞股藍總皂苷預處理對大鼠蛛網膜下腔出血后腦水腫和神經炎癥反應的影響*

常 江,張曉樂,余 華,陳 杰,李俊玲

1.陜西省中醫醫院腦病科 (西安710003) ;2.西安市中醫醫院婦科(西安710021)

蛛網膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)是腦卒中的一種重要類型，大大增加了患者死亡和致殘的風險[1-3]。研究證實，早期腦水腫可能是SAH患者腦神經功能癥狀加劇或死亡的關鍵因素[4]。研究表明，抗炎可以減輕實驗性SAH后的早期腦水腫[5-7]，提示抑制SAH后炎癥反應可能是緩解SAH后腦水腫及腦損傷的重要策略。絞股藍總皂苷(Gypenosides)是從葫蘆科植物絞股藍中提得的達瑪烷型皂苷，為絞股藍的重要成分[8-9]。絞股藍總皂苷具有顯著的抗炎效果，可緩解脂多糖誘導的神經炎癥反應和認知功能障礙[10-11]。在局灶性腦中風模型中，絞股藍總皂苷可減輕大鼠神經元的DNA損傷并促進腦室下區的神經干細胞增殖[12]。因此，本研究擬采用血管內穿刺法建立大鼠SAH模型，探討絞股藍總皂苷對蛛網膜下腔出血后腦水腫和神經炎癥反應的影響。

材料與方法

1 主要材料及設備 絞股藍總皂苷購自中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司；蛋白提取試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Nrf2抗體購自美國Abcam公司；β-actin內參抗體購自美國Santa Cruz公司；大鼠促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA檢測試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供；TUNEL凋亡檢測試劑盒由美國Roche公司提供；Evans blue染色試劑購自美國Sigma公司。

2 SAH模型的建立 正常大鼠用10%水合氯醛(2.5 ml/kg)腹腔注射后，做一正中頸部切口。按順序清晰顯露右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈后，4-0尼龍線頭經頸外動脈置入右頸內動脈，刺破大腦前動脈和大腦中動脈的分叉處，形成蛛網膜下出血[13-14]。

3 實驗分組 體重230～250 g雄性SD大鼠總計96只，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心。將其分為四組(n=24)，包括假手術對照組(Sham組)、蛛網膜下腔出血組(SAH組)、絞股藍總皂苷200 mg/(kg·d)組(GP1組)、絞股藍總皂苷400 mg/(kg·d)組(GP2組)。Sham組尼龍線不損傷血管壁；SAH組大鼠按照上述方法建立SAH模型；GP1和GP2組大鼠每日口飼絞股藍總皂苷溶液(溶于無菌生理鹽水)200或400 mg/kg共7 d[15]，之后建立SAH模型。

4 腦組織水含量和Evans blue外滲率檢測 參照文獻[13]測量大腦組織水含量。每組取大鼠6只，模型建立后24 h用過量戊巴比妥鈉(150 mg/kg)處死大鼠取腦，即刻稱得濕重。后再把標本放于100℃的烘箱中，72 h后稱重(干重)。腦組織水含量=([濕重-干重] /濕重)×100%。參照文獻[16]行Evans blue染色以評估血腦屏障損壞的程度。模型建立后24 h將2%Evans blue溶液(4 ml/kg)注入腹腔,3 h后用100 ml冰PBS液灌注大鼠，之后取出受損大腦右半球。把這些大腦半球樣本在PBS中勻漿并離心(30 min,15000 g,4℃)，回收上清液。取0.5 ml樣本與等量50%三氯乙酸混勻，在4℃下過夜反應后離心(30 min，15000 g，4℃)。最后，Evans blue染色值于分光光度計的610 nm處測得，單位以μg/g表示。

5 Western blot檢測和ELISA檢測 每組取大鼠6只，模型建立后24 h，過量戊巴比妥鈉(150 mg/kg)處死大鼠取腦，加入RIPA裂解液充分裂解。離心后將樣本上清均分，一份用于Western blot檢測Nrf2蛋白表達水平，另一份用于ELISA法檢測腦組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)和白細胞介素1β(IL-1β)含量。Western blot檢測：10%凝膠電泳后將蛋白電轉至PVDF膜上，5%BSA封閉后，加入抗β-actin抗體(1∶500)或抗Nrf2抗體(1∶1000)，4 ℃孵育過夜。第2天，使用HRP標記二抗室溫孵育PVDF膜0.5 h，用ECL顯影液反應并曝光，用Quantity one軟件分析條帶灰度值。ELISA檢測：根據廠家說明書，先后加入生物素化抗體工作液、酶結合工作液、顯色劑及終止液，用分光光度計在450 nm處測得吸光度值，并根據標準曲線定量。

6 TUNEL凋亡檢測 每組大鼠6只，模型建立24 h后用心臟灌注大鼠，取大腦組織于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規石蠟包埋后使用切片機將腦組織切成5 μm厚的切片。使用TUNEL凋亡染色試劑盒檢測腦組織石蠟包埋切片的凋亡細胞數。用PBS洗滌后，加入rTdT反應混合物于4℃過夜。PBS中漂洗后將切片與辣根過氧化物酶(稀釋比例1∶500)室溫下反應0.5 h。之后于室溫下加入DAB溶液處理10 min。最后，切片在乙醇分級脫水和二甲苯透明后于光鏡下(200×)計數，TUNEL陽性細胞細胞核呈現暗褐色。

結 果

1 四組大鼠SAH后腦組織水含量及Evans blue外滲率比較 見表1。SAH組大鼠腦水含量明顯高于Sham組(P<0.05)，而GP1和GP2組大鼠腦水含量明顯降低(P<0.05)；同時，GP2組大鼠腦含水量低于GP1組(P<0.05)。SAH組損傷半球Evans blue外滲率明顯高于Sham組(P<0.05)，而GP1和GP2組大鼠的外滲率明顯降低(P<0.05)；與GP1組比較，GP2組受損腦半球Evans blue外滲率明顯降低(P>0.05)。

表1 蛛網膜下腔出血后腦水含量和Evans blue外滲率比較

2 四組大鼠SAH后腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β含量比較 見表2。SAH組大鼠腦組織炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量明顯較Sham組增加(P<0.05)；而GP1和GP2組大鼠腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β含量較SAH組減低(P<0.05)；GP2組腦組織IL-6含量較GP1組減低(P<0.05)。

表2 四組大鼠SAH后腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β含量比較(ng/mg)

3 四組大鼠SAH后腦凋亡細胞數量和Nrf2蛋白表達水平比較 見表3(圖1、2)。

注：與Sham組比較，*P<0.05；與SAH組比較，△P<0.05；與GP1組比較，#P<0.05

注：與Sham組比較，*P<0.05；與SAH組比較，△P<0.05；與GP1組比較，#P<0.05

表3 蛛網膜下腔出血后腦組織凋亡細胞數量和Nrf2蛋白表達水平比較

可見，SAH組大鼠腦TUNEL陽性細胞數比Sham組明顯增加(P<0.05)；而GP1和GP2組大鼠腦TUNEL陽性細胞數顯著較少(P<0.05)；與GP1組比較，GP2組腦TUNEL陽性凋亡細胞更少(P<0.05)。SAH組大鼠腦Nrf2蛋白比Sham組明顯下調(P<0.05)；與SAH組比較，GP1和GP2組腦Nrf2蛋白明顯增加(P<0.05)。

討 論

本研究探討了絞股藍總皂苷在SAH后早期腦損傷中的抗腦水腫和抗炎作用。結果顯示，不同劑量的外源性絞股藍總皂苷可減輕SAH大鼠的腦水腫，保持血腦屏障完整性，顯著下調炎癥因子含量并減少細胞凋亡。這就提示，絞股藍總皂苷預處理可能是預防或緩解SAH患者早期腦損傷的有效替代療法。

腦水腫是蛛網膜下腔出血后的重要早期病理生理改變，也是導致SAH患者神經功能障礙的重要因素[4]。而神經炎癥反應可導致神經元細胞功能損傷和線粒體功能異常，是SAH后腦水腫發生發展的關鍵機制[17]。本研究采用經典血管內穿刺法建立了大鼠SAH模型，結果顯示，SAH后大鼠腦水含量和Evans blue外滲率顯著增加，細胞凋亡加重，受損腦皮質中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量明顯增加，驗證了SAH后腦水腫、血腦屏障破壞、細胞凋亡及神經炎癥反應加重的病理生理過程。

已有研究表明，絞股藍總皂苷在中樞神經系統中具有抗炎作用[10]。本研究進一步證實，絞股藍總皂苷預處理可顯著緩解SAH后促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子的表達。而SAH后這些促炎因子可加重血腦屏障的破壞、細胞凋亡及血管損傷，進而誘發腦水腫和神經功能損傷[18]。本研究結果顯示，絞股藍總皂苷預處理可減輕SAH后大鼠血腦屏障破壞和細胞凋亡。這就提示，絞股藍總皂苷對SAH大鼠的神經保護作用可能與其抗神經炎癥反應作用密切相關。

體外細胞研究已表明，絞股藍總皂苷預處理比后處理具有更強的神經保護作用[19]。在急性全腦缺血模型中，絞股藍總皂苷預處理已被證實可減少大鼠神經元DNA損傷[20]。在局灶性腦缺血模型中發現，絞股藍總皂苷預處理不僅可緩解腦急性缺血再灌注損傷，還能促進腦室下區的神經再生[12]。與之一致，本研究結果表明，絞股藍總皂苷預處理能有效緩解SAH后出現的腦水腫和神經炎癥反應，說明絞股藍總皂苷對于SAH具有潛在的預防作用。

轉錄因子Nrf2激活可有效減輕SAH后出現的腦損傷[21]。其作用機制可能與有效阻斷細胞氧化應激及炎癥相關信號通路相關[22]。已有研究證實，絞股藍總皂苷的腦保護和抗凋亡作用與Nrf2的激活密切相關。而本研究結果顯示絞股藍總皂苷預處理可顯著上調SAH后腦Nrf2的表達，提示SAH后絞股藍總皂苷的神經保護作用可能與Nrf2激活相關。

綜上所述，絞股藍總皂苷預處理可通過激活Nrf2信號通路減輕蛛網膜下腔出血造成的腦損傷和神經炎癥反應。