干擾素調(diào)控因子4對(duì)缺氧缺血性腦病新生大鼠炎癥反應(yīng)及血腦屏障功能的影響

葉莉娜,張 樂

1.陜西省渭南市婦幼保健院(渭南 714000)；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市涼城縣醫(yī)院(烏蘭察布 013750)

新生兒缺氧缺血性腦病(Hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是一種破壞性疾病，可導(dǎo)致兒童長期運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知障礙，目前仍是導(dǎo)致新生兒死亡和神經(jīng)后遺癥的主要原因[1]。缺氧缺血是一種強(qiáng)刺激，可引發(fā)血腦屏障損傷、免疫細(xì)胞快速活化至缺血病變，導(dǎo)致繼發(fā)性神經(jīng)元損傷[2-3]。干擾素調(diào)節(jié)因子4(Interferon regulatory factor 4，IRF4)是一種造血特異性轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)骨髓和淋巴譜系的發(fā)育和功能至關(guān)重要[4]。多項(xiàng)報(bào)道顯示，IRF4和抗炎反應(yīng)之間存在明顯聯(lián)系，而抗炎反應(yīng)在青年和老年小鼠中風(fēng)模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5-6]。IRF4基因敲除小鼠膿毒癥模型，其血清抑炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-4(IL-4)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)水平下降，而促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平顯著升高，表明IRF4信號(hào)的有益作用[7]。然而，目前尚不清楚IRF4是否調(diào)控新生兒大腦中HIE誘導(dǎo)的損傷。因此，本研究通過建立IRF4敲除大鼠HIE模型，評(píng)價(jià)IFR4對(duì)新生大鼠HIE表現(xiàn)行為的影響，并進(jìn)一步證明IRF4是新生大鼠HIE后炎癥反應(yīng)的強(qiáng)有力的調(diào)控因子。

材料與方法

1 主要試劑和儀器 TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-4和MMP-9 檢測ELISA試劑盒，美國Raybio公司；Image-J圖像分析軟件，美國Media Cybernetics公司。

2 新生大鼠HIE模型 IFR4敲除大鼠委托美國Jackson實(shí)驗(yàn)室采用TALEN技術(shù)(轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶)構(gòu)建。10只健康雄性10日齡SD大鼠(對(duì)照組)和10只10日齡IFR4基因敲除大鼠(IRF4KO組)，參照Rice-Vannucci(RVM)法[8]構(gòu)建HIE模型，2%異氟烷麻醉大鼠，電熱墊維持體溫36～38 ℃。切開頸部正中，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎，剪斷并縫合引起缺氧。術(shù)后將大鼠放置在電熱墊上20 min，并以1.5 L/min的速度輸入含10%O2和90%N2的低氧氣源2 h，然后放回籠中。術(shù)后7 d進(jìn)行行為功能測試，取材、取血清。

3 腦組織萎縮測定 HE染色視交叉水平的腦組織切片，采用圖像分析儀測定腦損傷面積、同側(cè)和對(duì)側(cè)半球面積，萎縮率=損傷側(cè)面積/健側(cè)半球面積×100%。

4 大鼠行為功能測定 ①癲癇活動(dòng)得分評(píng)定。癲癇活動(dòng)得分評(píng)定量表[9]制定如下：HIE術(shù)后5 min，記錄觀察到的最高癲癇活動(dòng)水平相對(duì)應(yīng)的分?jǐn)?shù)，并進(jìn)行匯總，得出癲癇活動(dòng)得分。評(píng)分如下：0=正常行為；1 =麻痹；2 =僵直；3=反復(fù)抓撓、打轉(zhuǎn)或搖頭；4=前肢陣攣；5=反復(fù)表現(xiàn)出4級(jí)行為；6=嚴(yán)重強(qiáng)直陣攣行為。②在HIE術(shù)前和術(shù)后7 d分別使用運(yùn)動(dòng)行為指數(shù)(MBI)評(píng)價(jià)大鼠的行為功能。MBI從六個(gè)方面進(jìn)行評(píng)定，包括：自發(fā)活動(dòng)、前爪伸展、攀爬、四肢對(duì)稱性、身體感覺、觸覺反應(yīng),總分范圍3～18分，得分越高，行為功能評(píng)價(jià)為越好。MBI比值(%)計(jì)算為術(shù)后第7天/術(shù)前分?jǐn)?shù)×100%。

5 ELISA檢測大鼠血清炎癥因子和MMP-9水平 TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-4和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)水平按照說明書采用ELISA試劑盒(美國Raybio公司)雙抗體夾心測試法進(jìn)行測定。

6 免疫組織化學(xué)檢測大鼠腦組織中MMP-9水平 2%異氟烷麻醉大鼠，心臟灌注磷酸鹽緩沖液。4%多聚甲醛固定、切片。注意在距離前囟相同距離處取腦切片，確保結(jié)構(gòu)相似。免疫染色切片用0.25% 的Triton X-100(美國Sigma公司)和10%血清封閉2 h,MMP-9抗體4 ℃孵育過夜。在切片的外邊界區(qū)域隨機(jī)選取5個(gè)視圖，使用Image J軟件盲法計(jì)數(shù)染色細(xì)胞。

結(jié) 果

1 兩大鼠HIE后腦組織萎縮情況比較 HIE術(shù)后7 d 大鼠的腦組織萎縮情況(圖1)。缺血性腦組織出現(xiàn)空洞或萎縮；定量結(jié)果顯示，IRF4KO組大鼠腦組織萎縮率明顯高于對(duì)照組[(42.48±4.87)與(25.38±2.60)，P<0.05]。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2 兩組大鼠HIE后行為表現(xiàn)評(píng)價(jià) 分別在HIE術(shù)后5 min對(duì)兩組大鼠進(jìn)行癲癇活動(dòng)得分評(píng)定(圖2A)。結(jié)果顯示，與腦萎縮程度一致，IRF4KO組大鼠癲癇活動(dòng)得分明顯高于對(duì)照組[(5.136 ± 0.206)與(3.682 ± 0.227)，P<0.05)]。MBI結(jié)果(圖2B)顯示，與對(duì)照組大鼠相比，IRF4KO組大鼠的評(píng)分顯著下降[(1.27±0.28)與(0.67±0.09)，P<0.05)]，表明IFR4敲除后大鼠HIE后行為表現(xiàn)顯著變差。

3 兩組大鼠HIE后血清炎癥因子水平比較 見表1。為探究IFR4缺失對(duì)血清中細(xì)胞因子的影響，采用ELISA試劑盒檢測了促炎因子IL-1β、TNF-α和抑炎因子IL-10、IL-4的水平，結(jié)果顯示，HIE后，與對(duì)照組相比，IFR4KO組大鼠血清中促炎因子IL-1β、TNF-α水平顯著升高[(148.92±30.48)與(50.69±5.12)、(136.74±20.32)與(87.28±16.30)，P<0.05]；而抑炎因子IL-10、IL-4的水平顯著下降[(32.32±8.25)與(50.75±10.32)、(38.20±9.13)與(55.52 ±12.32),P<0.05]。表明HIE后，IFR4基因敲除新生大鼠的炎癥反應(yīng)增加。

4 兩組大鼠HIE后血清和腦組織中MMP-9水平比較 為研究IFR4敲除是否對(duì)血腦屏障功能造成影響，我們采用ELISA試劑盒檢測了大鼠血清中MMP-9的水平，結(jié)果顯示，HIE后，與對(duì)照組相比，IFR4KO組血清中MMP-9水平顯著升高[(6.284 ± 0.393)pg/ml與(3.883 ± 0.330) pg/ml,P<0.05](圖3A)。此外，免疫組化結(jié)果所示，與對(duì)照組新生大鼠相比，IFR4KO組MMP-9染色細(xì)胞平均數(shù)量增加[(5.86±1.03)個(gè)與(9.01±2.15)個(gè)，P<0.05)](圖3B)。表明HIE后，IFR4基因敲除新生大鼠的血腦屏障功能受損。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

表1 兩組新生大鼠HIE后血清炎癥因子水平(pg/ml)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

討 論

新生兒缺氧缺血性腦病指在圍產(chǎn)期發(fā)生窒息現(xiàn)象而導(dǎo)致的腦組織缺氧缺血性損害，臨床主要表現(xiàn)為意識(shí)狀態(tài)變化、肌張力改變和驚厥等，已作為判斷新生兒腦病的嚴(yán)重程度和后遺癥的重要指標(biāo)[10]。可能導(dǎo)致新生兒顱內(nèi)出血、多器官的功能性損害、智力和運(yùn)動(dòng)障礙、癲癇，嚴(yán)重者危害新生兒的生命。治療過程中應(yīng)盡早開始腦細(xì)胞的保護(hù)治療，改善受損神經(jīng)元的代謝功能，維持機(jī)體內(nèi)各器官穩(wěn)定性。然而，目前尚無特效治療辦法。因此，應(yīng)積極尋找針對(duì)新生兒缺氧缺血性腦病的治療靶點(diǎn)，以改善預(yù)后，減少新生兒患者后遺癥的發(fā)生。

腦缺血誘發(fā)的炎癥反應(yīng)主要表現(xiàn)為：細(xì)胞因子、趨化因子、內(nèi)皮-白細(xì)胞粘附分子等的激活與釋放，導(dǎo)致缺血腦組織白細(xì)胞浸潤并加重腦組織損傷。研究表明，干擾素調(diào)控因子家族是調(diào)節(jié)缺血后神經(jīng)炎癥的促炎因子和抑炎因子水平的主要來源，而干擾素調(diào)控因子4(IRF4)則是干擾素調(diào)控因子家族中發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的主要因子[11]。此外，有研究者報(bào)道，IRF4在成年動(dòng)物模型的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)缺血性腦損傷后抗炎反應(yīng)增強(qiáng)，提示了IRF4的有益作用[8]。本研究對(duì)新生大鼠HIE后IRF4信號(hào)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明IRF4敲除的主要結(jié)果是增加HIE后的不良影響和炎性反應(yīng)，以此揭示IRF4對(duì)新生大鼠HIE事件的可能保護(hù)作用。此外，IRF4也被報(bào)道存在于神經(jīng)元中，可通過調(diào)節(jié)血清應(yīng)答因子(SRF)信號(hào)挽救缺血/再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡[12]。不過神經(jīng)元內(nèi)IRF4是否參與炎癥反應(yīng)尚不清楚。有趣的是，在Th2細(xì)胞中過表達(dá)IRF4可使抑炎細(xì)胞因子(IL-4和IL-10)表達(dá)增加[13]。先前的研究表明，缺血性中風(fēng)后，中性粒細(xì)胞是最早應(yīng)答的外圍細(xì)胞，并可導(dǎo)致血腦屏障功能損壞[14]。血清中細(xì)胞因子的水平反映機(jī)體對(duì)缺血損傷的免疫應(yīng)答情況[15]。中性粒細(xì)胞作為缺血性中風(fēng)后MMP-9的潛在分泌細(xì)胞，且中性粒細(xì)胞浸潤可提高缺血腦組織中MMP-9的水平。MMP-9是血腦屏障功能受損的重要標(biāo)志，腦缺血后神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的MMP-9水平均顯著升高[16]。MMP-9本身可以降解幾乎所有細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的成分，包括層粘連蛋白、纖連蛋白、IV型膠原蛋白等，并誘導(dǎo)血腦屏障破裂，促使周圍髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤大腦[17]。MMP-9的生成受抑炎細(xì)胞因子如IL-4和IL-10的負(fù)調(diào)控，我們的研究結(jié)果顯示，在IRF4敲除新生大鼠中，促炎因子IL-1β、TNF-α水平顯著增加，抑炎因子IL-4和IL-10水平顯著下降，而血清和腦組織中MMP-9水平顯著提高。

盡管如此，本研究仍存在著一定局限性。比如，本實(shí)驗(yàn)僅針對(duì)IRF4的基因敲除對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦病做了研究，并未涉及IRF4的過表達(dá)對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦病的神經(jīng)炎癥反應(yīng)的影響。此外，本研究僅采用了大鼠RVM法構(gòu)建的HIE模型。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)仍需研究其他類型的腦缺血，以更加全面地研究IRF4潛在的神經(jīng)抗炎作用。另外，本研究揭示了IRF4對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦病神經(jīng)炎癥的可能作用，但I(xiàn)RF4具體是通過何種通路減輕新生大鼠缺氧缺血性腦病神經(jīng)炎癥和血腦屏障受損的，尚有待進(jìn)一步研究闡明，以尋找治療缺氧缺血性腦病終生損害的新靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，IRF4的基因敲除對(duì)新生大鼠缺氧缺血后行為功能不利，導(dǎo)致新生大鼠缺氧缺血性腦病后大腦處于促炎環(huán)境中，且血腦屏障功能受損。提示了IRF4對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦病神經(jīng)炎癥的有益作用以及潛在的治療靶點(diǎn)。