ATP7B基因外顯率降低的機制及對Wilson病診斷的影響

梁晨 鄭素軍

Wilson病(Wilson’s disease，WD)是由于編碼銅轉運蛋白的ATP7B基因發生變異、造成體內銅代謝紊亂的常染色體隱性遺傳病。WD患者主要在5～35歲發病，臨床表現以進行性肝損傷和神經系統障礙為主，嚴重時可導致急、慢性肝衰竭，甚至死亡。WD若能早診早治，則預后良好，故診斷后主張立即開始治療[1]。鑒于目前基因診斷在WD診斷中的重要性，了解ATP7B基因突變的外顯率問題，有助于正確理解目前WD的基因診斷中存在的不足和缺陷，從而制定恰當的診療、隨訪措施[2-5]。本文就導致ATP7B基因外顯率降低的相關機制，以及其對WD診斷的影響作一綜述。

一、WD基因診斷存在的爭議和挑戰

基因測序技術無創、精準、特異性高。ATP7B基因突變檢測已成為患者診斷及親屬篩查的一線方法[6]。通過基因篩查，WD患者的確診時間平均可提前4年[3-4]。2012年歐洲肝病學會WD臨床實踐指南推薦的Leipzig評分系統[6]，是目前應用最廣泛的診斷方法，該評分系統凸顯了基因診斷的重要地位：當患者ATP7B基因存在2個致病性突變(復合雜合致病突變或純合致病突變)時，按照Leipzig評分可得4分，即可診斷為WD。然而，在臨床實踐中，考慮到WD常常需要終身藥物治療，而青霉胺等藥物常具有不同程度的毒副作用，對于無癥狀患者，是否僅憑借基因檢測就可以確診WD并立即啟動臨床治療，尚存在不同聲音，甚至造成一定的臨床決策困惑，值得深入探討[7-8]。

早期研究顯示，世界范圍內WD臨床患病率為1/30 000，ATP7B基因雜合突變攜帶率卻高達1/90。隨后的流行病學研究發現，遺傳上計算的患病率的確高于臨床實際患病率。例如英國ATP7B雜合突變基因攜帶頻率為1/25，預計攜帶2個致病性復合雜合突變頻率為1∶7 026，其遺傳患病率遠高于1/30 000[9]。某些近親結婚率低的國家，WD的臨床患病率較低，如法國WD臨床患病率為3/200 000，但ATP7B基因雜合突變攜帶率為1/31[10]。在世界范圍內，東亞地區國家的WD臨床患病率最高，為3/10 000，但韓國的ATP7B基因雜合突變攜帶頻率卻高達1/53[11, 12]。另外，近期有研究在排除人群和統計方法導致的差異后，對既往報道的致病性ATP7B基因突變的基因頻率進行薈萃分析，利用哈迪-溫伯格方程計算出全球WD的遺傳患病率為1/7 194，遠高于臨床患病率7/50 000[11]。綜上可知，世界范圍內WD的遺傳患病率遠高于臨床患病率。

既往曾有病例報道，對存在ATP7B基因c.3207C>A(p.H1069Q)純合子突變的、具有嚴重神經系統癥狀的WD患者的親屬進行基因篩查，發現患者同胞中有1例存在p.H1069Q純合突變，除KF環陽性外，雖然其未經任何系統治療，直至84歲也未出現可能與WD相關的癥狀[8]。另外，還有研究發現，一個家族多個親屬存在相同基因突變而臨床表型不同。該家族的先證者(31歲，男性)存在c.2129G>C(p.G710A)純合突變，由于暴發性肝衰竭而接受了原位肝移植治療。對該家族進行基因篩查后發現，其同胞(37歲，男性)存在相同突變，然而卻無任何與WD相關的癥狀及陽性檢查結果。15年后，先證者三代旁系親屬的下一代中出現1例存在c.2129G>C (p.G710A)/c.2128G>A(p.G710S)復合雜合突變的患者(16歲，女性)，因暴發性肝衰竭而進行了肝移植。進一步對該代其他成員進行基因篩查，發現1例存在c.2129G>C (p.G710A)/c.1607T>C(p.V536A)復合雜合突變、卻無癥狀的同胞(16歲，男性)[5]。

由以上研究可知，在同一家族中無癥狀個體，即使其攜帶與WD先證者相同的純合或復合雜合致病突變，也不一定影響銅轉運蛋白的功能而導致體內銅代謝紊亂，也不一定會出現臨床癥狀，故尚不能明確診斷為WD[5, 8]。實際上，其潛在原因是由于WD遺傳患病率與臨床患病率間存在明顯差異。ATP7B基因外顯率的降低目前被普遍認為是造成WD遺傳患病率較臨床患病率高的一種原因[5, 10]。

二、ATP7B基因外顯率降低的機制

外顯率是指具有特定基因型的個體，在特定的環境中表現出相應疾病臨床癥狀的比例，常用百分數表示。如果這個比例等于100%，則該基因或基因型為完全外顯率。反之，則為不完全外顯率，即外顯率降低。其多見于常染色體顯性遺傳病，但也可見于常染色體隱性遺傳病。大型的人口/家庭流行病學及基因篩查被認為是測量外顯率的必要手段。將1 000基因組項目(1 000 Genomes Project)測序結果(一般人群為主)與人類基因突變數據庫(Human Gene Mutation Database, HGMD)進行比較，結合美國醫學遺傳學與基因組學學會(the American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)與分子病理學會(the Association for Molecular Pathology，AMP)共同修訂的《序列變異分級標準指南》，發現健康的個體可以擁有大量的潛在致病變異，而不會表現出相應的臨床癥狀。所以，外顯率降低是人類遺傳學中普遍存在的一種現象[5, 13-14]。總結造成ATP7B外顯率降低的可能機制如下(圖1)。

圖1 ATP7B基因外顯率降低的相關機制

(一)ATP7B突變位點及突變類型對外顯率的影響 WD屬于常染色體隱性遺傳病，最常見的突變類型是錯義突變，其次是移碼突變、無義突變。錯義突變分別占所有可能性致病變異的52%、突變等位基因頻率的85%，其對外顯率的影響往往小于移碼、無義突變[11]；但也有例外，如目前在ATP7B信號肽區域發現的唯一的致病性錯義突變p.N41S，可導致銅轉運蛋白的錯誤定位，完全阻斷銅的轉運過程，使個體發病年齡較早。銅轉運蛋白活性消失或降低，還受ATP7B基因突變位點的影響。歐洲WD患者中最常見的突變位點為p.H1069Q。p.H1069Q突變導致銅轉運蛋白上高度保守的SEHPL結構域內、第1069位的氨基酸由組氨酸變成谷氨酰胺，從而影響銅在高爾基體上的跨膜轉運。一項對荷蘭WD患者p.H1069Q與臨床表型間關系的研究中發現，p.H1069Q純合或雜合突變的患者，比非p.H1069Q突變的患者發病更晚(平均年齡依次為20.9歲、15.9歲、12.6歲)。而且薈萃分析發現，p.H1069Q突變與Wilson疾病遲發有關,且純合突變比雜合突變的影響更大[15]，其原因可能是此突變導致銅轉運蛋白活性降低的程度小，對其功能影響小，導致體內具有潛在毒性的金屬銅蓄積較慢。然而也有研究顯示，即使突變發生在銅轉運蛋白相同的結構域內，其功能結果也有很大差異。如位于ATP結構域的p.P840L與同一結構域內的p.I857T相比，前者對銅轉運蛋白功能的影響更大[15]。綜上，同一基因中突變位點不同，其外顯率可能不同；在同一基因區域，某些特定突變位點也會影響外顯率，且等位基因的數量也可影響外顯率[13]。

(二)ATP7B基因單核苷酸多態性對外顯率的影響 單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)是指發生在一般人群基因組水平上的單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，變異頻率大于1%，通常被認為是良性變異[13]。有研究報道，ATP7B基因中常見的SNPs位點，如p.K832和p.R952，并沒有從根本上影響銅轉運蛋白的功能，但可調節銅轉運蛋白的化學性質和細胞內的銅穩態[16]。所以，在具有ATP7B致病突變的WD患者中，SNPs的存在可能會加劇致病突變的作用，從而影響WD的外顯率。另一方面，雖然ATP7B SNPs對體內銅代謝過程的影響較小，但由于不同個體之間及環境差異等的影響，可能也會存在僅攜帶SNPs位點的WD患者[16-17]，即SNP表現出致病性。

(三)ATP7B基因調控因子、多種相關蛋白表達水平對外顯率的影響 銅在體內的蓄積水平以及是否引起病理后果，也受ATP7B基因調控因子，和多種相關蛋白的表達水平的影響[18]。基因表達受順式和反式調節因子的組合調控[13]。順式作用元件本質上是一段DNA序列，包括啟動子、增強子、調控序列和可誘導元件等，存在于基因序列的上游或下游。反式調節因子是指能直接或間接地識別、結合順式作用元件序列，參與調控靶基因轉錄的蛋白質。ATP7B基因表達的最終產物是銅轉運蛋白[4]，因此順式作用元件或反式調節因子的多態性可通過調控ATP7B基因的表達，來介導銅轉運蛋白活性的高低，進而影響ATP7B基因的外顯率。

另外，多種相關蛋白是否正常表達在調節ATP7B基因的外顯率中也發揮著重要作用。例如，在胞質內傳遞銅離子到銅轉運蛋白所必須的HAH1伴侶蛋白，腸道內可大量結合金屬離子的金屬硫蛋白，以及可以在細胞水平上對抗銅誘導的氧化應激能力的谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和熱休克蛋白等[18-19]。

(四)修飾基因對ATP7B基因外顯率的影響 WD患者ATP7B基因型-臨床表型之間存在不完全一致現象，表明存在修飾基因。修飾基因是指本身具有或者不具有表型效應，和另一突變基因同時存在時會影響另一基因的表達程度的基因。這些修飾基因可影響個體對銅的耐受力或體內銅的儲存能力。目前一些研究開始探索除ATP7B以外的突變基因對WD表型表達的作用[14]。

載脂蛋白e(ApoE)是中樞神經系統膽固醇和脂類轉運的關鍵蛋白,也是肝臟的脂質轉運蛋白之一。銅的細胞毒性作用是通過參與脂質過氧化反應、產生自由基導致細胞膜損傷來介導的。ApoE可以結合金屬離子起到抗氧化作用，不同ApoE亞型對金屬的親和力不同，其中ApoE3對銅的親和力最高。有研究發現，在相同的ATP7B基因遺傳背景(納入患者均為純合p.H1069Q)下，不同的ApoE基因型是神經系統和肝臟癥狀延遲發生的重要因素之一[20]。其中，攜帶ApoEε3/3基因型的患者較其他基因型(ApoEε3/2，ApoEε3/4，ApoEε4/2)患者，出現神經系統和肝臟癥狀的時間明顯晚、癥狀輕。故ApoE基因可通過抗氧化和保護細胞膜的完整性，延緩WD發生，且ApoEε3/3比其余基因型更有效。另外，ApoE4也被發現是阿爾茨海默癥的危險因素，并可影響創傷性腦損傷造成的神經系統障礙的預后[20-22]。印度一項研究顯示，與健康對照組相比，WD患者中ApoE4等位基因的比例明顯升高，考慮ApoE4可能是WD發病的潛在風險因子，但該結果需要在更大的隊列中進行驗證[23]。

當ATP7B基因突變導致銅轉運蛋白功能受損時，除上述ApoE基因外，由于一些其他調節銅代謝過程的基因(如MTHFR、COMMD1、ATOX1、HAH1等)的干預，可能會使WD患者的銅代謝參數正常，但目前它們在WD中的重要作用尚未完全明確[22, 24]。另外，Patatin樣磷脂酶結構域蛋白3(PNPLA3)主要參與甘油三酯代謝過程，PNPLA3突變最常見于非酒精性脂肪肝(NAFLD)患者中，也被發現與WD患者中肝細胞、肝星狀細胞中甘油三酯蓄積有關，故PNPLA3可能通過調節肝臟脂肪變性的嚴重程度，來影響ATP7B基因的外顯率[4]。

(五)年齡、性別對ATP7B基因外顯率的影響 既往報道顯示多種遺傳性疾病的外顯率與患者年齡相關，WD也不例外[7]。一項迄今為止，納入了最大WD患者隊列的研究表明，年齡可有效地影響WD的臨床表型[25]。通常，年齡<10歲的WD患者以肝臟癥狀為首發表現，而青春期和成年發病的WD患者多以神經系統障礙為首發癥狀。

遺傳突變外顯率與性別相關，可能是由于男女之間受差異基因的調控，特別是與性激素相關的基因[7]。雌激素可作為神經營養因子參與神經再生過程。另外，雌激素在慢性肝炎、肝纖維化、NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中的保護作用也在臨床和基礎實驗研究中得到了證明[21]。在切除卵巢的WD大鼠模型中發現，性激素對WD大鼠的發病率無影響，但可影響其病程進展；另外，外源性睪酮可提高爆發型肝衰竭WD大鼠的存活率，外源性雌二醇可延遲WD大鼠的發病[26]。攜帶p. H1069Q純合突變的荷蘭WD患者中女性較多，其發病較晚，原因可能是由于雌激素的保護作用；但進一步對p. H1069Q基因型與性別間關系進行薈萃分析，未發現統計學意義[15]。也有研究發現，排除了暴發性WD和溶血性貧血的病例后，不同性別WD患者間肝臟表型無差異，但對于神經系統表現仍有統計學意義，其原因可能是雌激素對神經系統的保護作用[25]。

(六)環境、表觀遺傳修飾及其他因素對ATP7B基因外顯率影響 除了上述因素外，環境、表觀遺傳修飾和多種代謝物等因素，似乎也在影響ATP7B基因外顯率方面起著關鍵作用。日常飲食中銅和鋅、酒精、感染、某些細菌的代謝產物(如大腸桿菌等)、可促進飲食中金屬離子吸收的食品添加劑(如姜黃素等)等環境因素，可直接調節膳食銅的吸收，進而影響ATP7B基因外顯率[5, 15, 25]。

對于遺傳和環境背景相同的同卵雙胞胎，其臨床表型通常不完全相同，說明突變的不完全外顯率是經常發生的，應該考慮表觀遺傳修飾(如DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質重塑)的影響[19, 27]。排除后天的環境及表觀遺傳修飾的影響，同卵雙胞胎突變外顯率降低的原因還有多種不同的遺傳學解釋，如受精卵分裂后的突變、代償性突變和體細胞拷貝數變異等。

三、總結與展望

目前，ATP7B基因檢測是協助WD診斷的重要手段[1]。然而，研究顯示，ATP7B基因外顯率并不是100%。部分人群即使攜帶ATP7B純合或復合雜合致病突變，體內也不一定存在銅代謝障礙，不見得發病。許多基因突變可能只是條件致病性的，只有當遺傳和外部環境等上述因素間相互作用，使患者體內銅蓄積到某種概念上的閾值時，才會產生病理狀態。因此，對于無癥狀WD患者，分子診斷仍具有挑戰性，僅憑基因檢測有時并不足以做出臨床和治療決策，尚需結合其他檢查(如銅藍蛋白、24小時尿銅定量、眼睛KF環、肝功能、肝組織銅定量、肝臟及頭顱影像學等)來綜合判斷[5, 7]。部分僅檢出存在純合或復合雜合致病性突變、而無任何癥狀及體征的人群，經過全面評估，可以在患者充分知情同意的情況下，可暫不進行治療，但應定期進行隨訪監測。

總之，目前ATP7B基因外顯率降低的機制仍未完全闡明，仍需進一步研究。這也對目前常用Leipzig評分中、單憑基因檢測(復合雜合突變或純合突變4分)就做出WD診斷的可靠性，提出了新的挑戰，有必要進一步完善這一診斷標準，相應的無癥狀WD患者的臨床治療及隨訪管理方案也需要進一步研究和制定。