袁寶玉 武強 周聰 沈芳

腸道菌群是人體腸道內(nèi)定植的種類多、數(shù)量大、功能復(fù)雜的微生物群體，在機體生理、病理過程中發(fā)揮重要作用[1]。目前腸道菌群是研究熱點[2]，大量研究[1]表明，腸道菌群穩(wěn)態(tài)失衡是影響多種疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，可以影響與腸道緊密相連的肝臟功能。目前證實腸道菌群失調(diào)和艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)關(guān)系密切，腸道菌群紊亂后導(dǎo)致艱難梭菌(Clostridiumdifficile, CD)過度繁殖并釋放毒素[3]，發(fā)生CDI及相關(guān)腹瀉，嚴重時可致偽膜性結(jié)腸炎，甚至死亡[4]。本研究對老年住院患者糞便標本進行CD相關(guān)檢測，初步探討腸道CD定植對老年人肝生化指標的影響。

資料與方法

一、材料來源

選取2019年4月-10月復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院住院的老年患者187例作為研究對象，采集研究對象的糞便標本進行檢測。入選標準：(1)年齡≥60歲；(2)標本收集時無明顯腹瀉癥狀，標本收集后72 h內(nèi)未發(fā)生腹瀉癥狀。排除標準：(1)先前有CDI病史者；(2)嚴重肝腎功能不全患者；(3)研究期間再次入院患者；(4)臨床信息缺失患者；(5)入院48 h未排便患者。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

二、儀器與試劑

肝生化指標分析，瑞士羅氏公司Cobas 8000儀器及配套試劑；腸道艱難梭菌CDIF選擇性培養(yǎng)基，法國Bio Mérieux公司；艱難梭菌谷氨酸脫氫酶抗原及毒素檢測試劑盒，美國 Abbott 公司；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜分析儀(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF-MS)，德國 Bruker Daltonics 公司。

三、方法

(一)研究對象臨床信息采集 通過調(diào)取電子病歷收集并整理患者的臨床資料，主要包括年齡、性別等人口學(xué)特征以及血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總蛋白、白蛋白、膽紅素等肝生化指標等。

(二)糞便標本厭氧培養(yǎng)及鑒定 規(guī)范采集患者糞便標本并及時送檢。用無菌棉簽挑取1 g糞便標本置于離心管中，加入等體積無水乙醇，混勻，離心去上清，取沉淀混合物接種到艱難梭菌CDIF選擇性培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h，菌落呈灰黑色、扁平狀，表面粗糙且?guī)в衅交虿灰?guī)則邊緣，利用MALDI-TOF MS儀對可疑菌落進行鑒定，鑒定為CD陽性的菌株轉(zhuǎn)種到血平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，進行純化分離并保存菌株。

(三)免疫學(xué)檢測谷氨酸脫氫酶抗原(Glutamate Dehydrogenase, GDH)、毒素A、毒素B

參考試劑盒說明書，挑取5個菌落至750 μL稀釋液中，滴加1滴酶結(jié)合物，震蕩，混勻；吸取500 μL混合物加入測試卡加樣孔中，室溫下孵育15 min；加入300 μL清洗緩沖液于反應(yīng)窗口中，待其徹底吸收；最后滴加2滴底物于反應(yīng)窗口中，10 min后讀取并記錄結(jié)果。反應(yīng)窗口中同時顯示兩條藍色線條記為產(chǎn)毒株。

四、統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)和百分比(n, %)表示，組間比較采用卡方或Fisher確切概率法檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、187例老年住院患者CD培養(yǎng)和毒素檢測結(jié)果

本實驗用CDIF選擇性培養(yǎng)基對187份糞便樣本進行CD分離培養(yǎng)，分離到疑似菌株共43株，經(jīng)質(zhì)譜分析儀鑒定35株為CD，納入后續(xù)實驗，陽性率為18.72%。免疫學(xué)檢測GDH、毒素A、毒素B，GDH陽性率為100%，毒素陽性率為82.85%(29/35)。見圖1。

二、187例老年住院患者肝生化指標檢測結(jié)果

與CD非定植組比較，老年患者定植組肝生化指標白蛋白<35 g/L、前白蛋白<0.20 g/L、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶>41 U/L 、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶>40 U/L、總膽汁酸>10 μmol/L、總膽紅素>21 μmol/L、直接膽紅素>5 μmol/L比例較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組比較總蛋白、球蛋白、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和堿性磷酸酶差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

三、187例老年住院患者人口學(xué)特征情況

35例老年CD定植患者中，按照年齡分布，60～69歲有10人，70～79歲有12人，80～89歲有11人，90歲以上有2人，與非定植組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，老年住院患者CD定植率隨年齡增大而升高。按照性別分布，男性17例，占48.57%，定植率為20.48%，較女性17.31%的定植率略高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

注：A：艱難梭菌陽性質(zhì)譜圖；B：艱難梭菌免疫學(xué)檢測結(jié)果，其中上圖為GDH+、毒素A+、毒素B+，中間為GDH+、毒素A-、毒素B-，下圖為GDH-、毒素A-、毒素B-

表1 187例老年住院患者肝生化指標情況[n(%)]

表2 187例老年住院患者性別年齡分布

討 論

老年人免疫功能降低，易患各類基礎(chǔ)疾病，住院時間相對較長或反復(fù)入院，可導(dǎo)致腸道菌群生物多樣性降低，增加感染風(fēng)險[5]。根據(jù)美國流行病學(xué)研究，70%-80%CDI發(fā)生在65歲及以上老年人中[6]。老年人是CDI高危人群[7, 8]。但僅關(guān)注CDI患者不足以預(yù)防CD造成的院內(nèi)感染，研究發(fā)現(xiàn)CDI患者可能僅占院內(nèi)新增CDI病例的四分之一[9]。CD無癥狀攜帶者，可能是醫(yī)院環(huán)境持續(xù)污染的根源，與CD傳播及感染暴發(fā)密切相關(guān)[10, 11]，應(yīng)加強對腸道CD定植老年患者的關(guān)注。

本研究對老年患者進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)入院老年患者CD定植率為18.72%，略高于國外研究報道的4.4-15%[14]，產(chǎn)毒素菌株比例高(82.85%)，分析原因可能與患者年齡大、免疫功能下降、住院時間長有關(guān)。應(yīng)當指出的是，入院時產(chǎn)毒CD定植患者發(fā)生CDI的風(fēng)險幾乎是非定植者的6倍[15]，且產(chǎn)毒CD定植患者可通過直接或間接接觸傳播到其他易感患者或環(huán)境中[16]。為防止醫(yī)院CDI傳播，建議盡早識別入院產(chǎn)毒CD定植患者并及時實施預(yù)防感染控制措施。

本研究將老年住院患者CD定植組與非定植組進行肝生化指標比較，觀察到定植組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽汁酸超出正常水平患者較多，總膽紅素、直接膽紅素(P<0.05)，提示CD定植患者肝細胞可能受到損傷，肝臟轉(zhuǎn)化、排泄功能可能受影響。白蛋白、前白蛋白兩個指標反映人體肝臟合成能力，是評估機體營養(yǎng)狀態(tài)的常用指標，本研究結(jié)果顯示定植組患者血清白蛋白、前白蛋白水平異常比例較高(P<0.05)，提示CD定植可能對老年人肝臟合成蛋白能力產(chǎn)生一定影響，CD定植老年患者營養(yǎng)狀態(tài)相對較差，免疫功能降低，易引起感染[12]，加大CDI風(fēng)險。

研究顯示[13]，高齡是CD定植和感染的危險因素，本研究也有類似結(jié)果，隨著老年住院患者年齡增大，定植率從12.82%、17.65%、28.95%增加到66.67%，分析原因可能與老年人機體免疫狀態(tài)有關(guān)。

本研究對老年患者入院時CD定植情況進行研究，研究結(jié)果顯示，CD定植率略高于國外報道，產(chǎn)毒CD比例較高，定植組肝腎功能指標異常比例高于非定植組。CD定植可能對老年患者肝功能造成一定影響，且定植患者發(fā)生CDI風(fēng)險增加，加重臨床治療負擔(dān)，提示醫(yī)務(wù)人員應(yīng)提高CD認識水平和檢測能力，加強對年齡大、免疫功能低下且有基礎(chǔ)疾病的老年人入院時CD篩查和監(jiān)測，若發(fā)生不明原因腹瀉，應(yīng)及時明確是否發(fā)生CDI，從而早診斷、早治療。