上海市公共衛生臨床中心2015—2019年乙型肝炎病毒基因突變分析

張莉 孟現民 董平

中國約有7 000萬乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)感染者，2 000萬～3 000萬慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者[1]。乙肝防控工作形勢嚴峻，對有抗病毒指征的患者進行及時、有效的治療以避免疾病進展十分重要[2]。核苷(酸)類似物(nucleoside/nucleotide analogues，NAs)難以徹底清除HBV，需長期使用[3]，前期大量使用低耐藥屏障藥物繼發耐藥使后續治療變得棘手，掌握HBV耐藥情況可以指導合理用藥[4]。本研究通過對上海市公共衛生臨床中心的HBV基因檢測結果進行分析，獲得HBV耐藥突變位點分布情況以及對各種NAs的耐藥率，并進一步探析了HBV耐藥的影響因素。

資料與方法

一、研究方法

選取我院2015年—2019年診斷為CHB且送檢HBV基因檢測的患者，對HBV RT區的I169、V173、L180、A181、T184、A194、S202、M204、N236、M250共10個位點的突變情況進行統計，并計算同期內NAs的消耗頻度及其占比。對2019年開展基因檢測的患者，錄入性別、年齡、HBV DNA、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、HBV血清標志物以及HBV基因型，剔除合并HCV、HIV、HBV DNA <500拷貝/mL或<100 IU/mL以及檢測結果不完整的患者，探析HBV耐藥突變的影響因素。

二、統計學方法

采用統計軟件SPSS 23.0對數據進行分析，以四分位數M(QL，QV)表示不符合正態分布的計量資料，組間差異采用曼-惠特尼檢驗；計數資料以率(%)表示，組間差異采用皮爾遜卡方或費希爾精確檢驗。多因素分析采用二元logistics回歸分析。P<0.05認為有顯著性差異。

結 果

一、 HBV基因檢測結果

2015年—2019年共有4 182例次CHB患者進行了乙肝基因檢測，男性2 937例，女性1 245例；年齡41(32,54)歲；發生突變651例，突變率15.57%；突變率從2017年開始下降，2019年降至7.70%，詳見表1。我院用于CHB治療的NAs以恩替卡韋(占43.07%)為主，其次是阿德福韋(占27.35%)，高效低耐藥品種恩替卡韋、替諾福韋的使用占比逐年升高，拉米夫定、阿德福韋以及替比夫定的使用占比逐年減少。本研究納入的10個位點突變率分別為rtM204 13.46%(563例)、rt L180 8.18%(342例)、rtA181 1.79%(75例)、rtV17 30.88%(37例)、rtN236 0.57%(24例)、rtS202 0.12%(5例)、rtM250 0.10%(4例)、rtT184 0.10%(4例)、rtI169 0.02%(1例)。

表1 2015年—2019年HBV基因突變及NAs占比情況

651例CHB患者的HBV基因突變以32種模式呈現，突變模式多樣。其中287例患者為單位點突變，有6種模式；324例患者為雙位點突變，有14種模式；36例患者有3個位點突變，有10種模式；1例患者有4個位點突變。詳細的基因突變情況見表2。

二、 HBV的基因突變的耐藥解讀

本研究32種突變模式中有28種可導致耐藥。涉及拉米夫定耐藥的模式有27種，630例，耐藥率15.06%；涉及阿德福韋酯耐藥的模式有13種，89例，耐藥率2.13%；涉及恩替卡韋耐藥的模式有6種，9例，耐藥率0.22%。剩余4種突變類型中，L180M為單純的補償突變，不直接導致耐藥；I169L和M250L+N236V為恩替卡韋耐藥的聯合突變位點，暫不明確其在不伴M204聯合L180突變時的意義，但是需要關注此類突變對恩替卡韋的敏感性改變；N236V為阿德福韋的非經典突變，需要關注其對阿德福韋以及替諾福韋的敏感性改變；M204S+L180M為拉米夫定的非經典突變，需要關注其對拉米夫定和恩替卡韋的耐藥可能[4-7]。

557例為HBV單耐藥，拉米夫定單耐藥545例(占85.02%)，阿德福韋單耐藥12例(占1.87%)；73例雙重耐藥，拉米夫定、阿德福韋雙重耐藥65例(占10.14%)，拉米夫定、恩替卡韋雙重耐藥8例(占1.25%)；1例(占0.16%)同時對拉米夫定、阿德福韋與恩替卡韋呈現三重耐藥。

三、 HBV耐藥的影響因素分析

2019年符合要求的患者有323例，其中耐藥47例(14.55%)，不耐藥276例(85.45%)，男性210例(65.94%)，女性113例(34.06%)，年齡 41(32，54)歲，B基因型104例(32.20%)，C基因型219例(67.80%)。

(一)影響HBV耐藥的單因素分析 將患者年齡、性別、基因型、HBV DNA(統計時取對數)、ALT、AST、HBV血清標志物檢測結果對耐藥的影響進行單因素分析，結果顯示年齡、基因型、ALT、AST、HBeAg、HBeAb對突變有影響(P<0.05)，性別、HBV DNA、HBsAg、HBsAb以及HBcAb對耐藥沒有影響(P>0.05)，詳見表3。

(二) HBV耐藥影響的多因素分析 將患者年齡、基因型、HBV DNA、ALT、AST、HBeAg、HBeAb對耐藥的影響進行多因素logistics回歸分析，結果顯示、基因型、HBV DNA、ALT、AST、HBeAg與耐藥不相關，年齡和HBeAb與耐藥相關，年齡越大、HBeAb陰性的CHB患者更加容易發生耐藥，詳見表5。

表2 HBV 基因突變模式

表3 HBV突變的影響因素分析

討 論

HBV是一種高變異病毒，不僅在慢性持續感染中可以發生自然變異，還可因暴露于抗病毒藥物誘導變異，進而導致其對抗病毒藥物產生耐藥，因此HBV的耐藥問題值得關注[3, 8]。本研究結果顯示，2015年-2019年上海市CHB患者的HBV基因突變率15.57%，與Guo Xianghua等[9]報道的中國北方35.31%以及Zhang Hongyu等[10]報道的江蘇30.8%相比明顯較低，與普冬等[11]報道的昆明10.1%相比偏高，考慮與各地報道的年份不同有關，中國的HBV耐藥率比土耳其46.86%普遍較低[12]。2009年-2016年期間，中國北方的HBV的耐藥率逐年下降[9]，江蘇地區的耐藥率逐年升高[10]，本研究顯示上海市HBV耐藥率逐年下降，2019年降至7.7%，結合我院的NAs應用情況，考慮耐藥率降低與高耐藥屏障藥物恩替卡韋、替諾福韋和丙酚替諾福韋的使用占比逐年增加有關[13-14]。

本研究檢測的HBV位點突變率以rtM204(13.46%)最高，其次為rtL180(8.18%)和rtA181(1.79%)。最多見的突變模式為rtM204I單位點突變，占所有突變例數的32.41%，其次為rtM204V+ rtL180M和rtM204I +rtL180M，分別占29.34%和16.43%；rt M204突變主要引起左旋核苷類耐藥，也是恩替卡韋耐藥的聯合突變位點，rtL180與rtM204聯合突變后，只需再突變1個位點(rtI169或rtT184或 rtS202或 rtM250)，就能引起恩替卡韋耐藥[4, 6]。上海市HBV對拉米夫定耐藥率15.06%最高，其次是阿德福韋2.13%和恩替卡韋0.22%，與其他研究[9]報道的27.23%、9.67%和3.69%相比均較低，考慮與抽樣時間不同有關。值得關注的是，本研究中恩替卡韋耐藥率雖只有0.22%，但rtM204與rtL180聯合突變率達7.13%，加上恩替卡韋的使用占主導且逐年增加，未來需高度警惕HBV對恩替卡韋耐藥突變率升高的可能[15]。指南[1]將至少對2種不同類別NAs耐藥定義為多重耐藥，本研究中HBV多重耐藥發生率1.77%(74例)，與Zhang等[10]報道的7.45%相比較低。替諾福韋從2015年開始用于治療CHB，截至2019年沒有發生替諾福韋耐藥的情況，提示替諾福韋治療CHB五年內出現耐藥的概率較小[16 ]。

本研究對HBV耐藥的影響進行單因素分析，發現年齡、基因型、ALT、AST、HBeAg和HBeAb與耐藥有關；進一步對HBV耐藥的影響進行多因素分析，發現年齡和HBeAb陰性是導致HBV耐藥的危險因素。隨著患者年齡增長，HBV發生耐藥的風險升高。這與我國現有的CHB患者的HBV感染多源于嬰幼兒時期的母嬰垂直傳播和兒童間水平傳播有關[1, 7]，年齡越大，HBV感染時間越長，長時間慢性感染HBV病毒復制未得到有效抑制，更容易發生耐藥突變。另外，HBeAb陰性的患者發生HBV突變的概率是HBeAb陽性患者的9.423倍，提示臨床需重視HBeAg陰性CHB患者的耐藥情況，必要時及時進行基因突變檢測。

上海市HBV耐藥率逐年下降，突變模式多樣，尤以拉米夫定耐藥最常見，拉米夫定和阿德福韋雙重耐藥也有發生。對治療效果不佳的患者，建議及時送檢HBV基因檢測，換用替諾福韋酯或丙酚替諾福韋酯，并加強對HBV DNA以及血生化指標的監測。對于正在應用非首選藥物治療的患者，也建議換用強效低耐藥品種。未來需要加強監測HBV對恩替卡韋耐藥的情況。