慢性乙型肝炎患者血清外泌體mir-122、mir-146a表達與HBV DNA載量的相關性

劉嬌 劉青 王大明 賈興旺

我國是慢性乙型肝炎(CHB)高發區，目前全球約有2.4億人攜帶乙型肝炎病毒(HBV)，HBV感染可導致急性或慢性肝炎，是引起肝纖維化、肝硬化、肝癌重要因素之一[1-2]。微小RNA(miRNA)對肝損傷十分敏感，mir-122、mir-146a均是免疫相關性miRNA，可參與細胞免疫應答及炎癥反應，mir-122可預測干擾素治療CHB的效果，且與HBV DNA高載量CHB患者肝損傷及預后有關，mir-146a與肝癌、肝損傷等肝臟疾病密切相關[3-7]。外泌體中含有大量HBV DNA及miRNA等成分，是HBV一種重要傳播介質[8,9]。 本研究探討CHB患者血清外泌體mir-122、mir-146a表達水平，以及其與HBV DNA載量的關系，為臨床CHB的靶向治療提供參考依據。

資料與方法

一、一般資料

收集2018年5月至2019年12月南京醫科大學深圳醫院收治的CHB患者285例。患者納入標準：①符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[10]中關于CHB的診斷標準；②血清樣本采集前患者未接受任何治療；③臨床檢測資料完整。排除標準：①合并肝癌或其他腫瘤者；②妊娠或哺乳期婦女；③合并脂肪肝或其他類型肝炎病毒感染者；④心、肺、腎等臟器功能異常或嚴重病變者。根據血清外泌體HBV DNA載量，分為3組，每組95例：低載量組(HBV DNA<1×105拷貝/mL)，其中男性65例，女性30例，年齡18～75歲；中載量組(1×105拷貝/mL ≤HBV DNA≤1×107拷貝/mL)男性66例，女性29例，年齡19～76歲；高載量組(HBV DNA>1×107拷貝/mL)，男性67例，女性28例，年齡18～75歲。另取同期門診健康體檢者血清標本95名為對照組，男性63名，女性32名，年齡18～76歲。4組受試者性別、年齡比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經過本院倫理委員會批準通過，所有樣品采集及資料調查均取得受試者及其家屬知情同意并簽字確認。

二、主要試劑及儀器

RNA提取試劑盒購自上海碧云天有限公司；Exosome Isolation Reagent試劑盒購自上海歌凡生物科技有限公司；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒、microRNA定量(qRT-PCR)試劑盒購自日本TaKaRa生物公司；透明質酸酶(HA)檢測試劑盒購自鄭州安圖生物工程股份有限司)；Ⅲ型前膠原(PC Ⅲ)試劑盒購自上海彩佑生物科技有限公司；Ⅳ型膠原(C Ⅳ)試劑盒購自南京萊富賽生物科技有限公司；層粘連蛋白(LN)試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司；引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成。MODEL550型酶標儀、7500型qRT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

三、方法

(一)血清外泌體制備 采集所有受試者晨起空腹外周靜脈血10 mL，3000 r/min(離心半徑為10 cm)，4℃離心10 min ，收集血清。采用血清外泌體提取試劑盒提取血清中外泌體，具體步驟嚴格按照說明書進行。提取物中外泌體采用透射電鏡觀察鑒定。

(二)血清外泌體HBV DNA載量檢測 采用實時定量PCR(RT-qPCR)檢測血清外泌體HBV DNA載量。

(三)血清外泌體mir-122、mir-146a水平檢測 所有受試者均分別取50 μL外泌體樣本，采用RNA提取試劑盒提取外泌體總RNA，反轉錄得cDNA置于-20℃保存備用。采用RT-qPCR法對mir-122、mir-146a進行擴增。反應體系共25 μL：SYBR Premix ExTaqⅡ(2×)12.5 μL，cDNA(50 ng/μL)2 μL，上下游引物(10 μmol)各1 μL，ddH2O 8.5 μL。反應條件為：95℃ 5 s；95℃ 30 s；60℃ 30 s；72℃ 15 s；40個循環；添加溶解曲線。mir-122上游引物序列(5′→3′)為：CCC GTG ATG CTT CTT TTC TC，下游引物序列(5′→3′)為：ATG TGA GAG GCA GGG TTC AG；mir-146a上游引物序列(5′→3′)為：CAT GGG TTG TCT CAG TGT CAG AGC T，下游引物序列(5′→3′)為：TGC CTT CTG TCT CCA GTC TTC CAA；內參U6上游引物序列(5′→3′)為：GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T，下游引物序列(5′→3′)為：CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT。采用2-△△CT法對血清外泌體mir-122、mir-146a相對表達水平進行定量分析。

(四)血清肝纖維化指標檢測 采用化學發光法檢測血清肝纖維化指標，主要包括HA、PC Ⅲ、C Ⅳ及LN，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。HA正常范圍<120 ng/mL ；PC Ⅲ 正常范圍<15 ng/mL； C Ⅳ正常范圍<95 ng/mL；LN：正常范圍<130 ng/mL。

四、統計學分析

結 果

一、4組患者血清外泌體HBV DNA 載量及mir-122、mir-146a表達水平比較

與對照組比較，低、中、高載量組血清外泌體HBV DNA 載量及mir-122水平依次增加，mir-146a表達水平均依次降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

二、4組患者血清肝纖維化指標比較

與對照組比較，低、中、高載量組血清肝纖維化指標HA、PC Ⅲ、C Ⅳ、LN水平均依次增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

三、CHB患者血清外泌體mir-122、mir-146a表達水平與HBV DNA 載量的相關性

結果顯示，血清外泌體mir-122與mir-146a水平呈負相關(r=-0.765，P<0.05)，與HBV DNA 載量呈正相關(r=0.773，P<0.05)；mir-146a與HBV DNA 載量呈負相關(r=-0.840，P<0.05)。

四、CHB患者血清外泌體mir-122、mir-146a表達水平與肝纖維化指標的相關性

結果顯示，血清外泌體mir-122水平與HA、PC Ⅲ、C Ⅳ、LN水平均呈正相關(r=0.764、0.699、0.665、0.697，P<0.05)，mir-146a水平與HA、PC Ⅲ、C Ⅳ、LN水平均呈負相關(r=-0.779、-0.731、-0.691、-0.738，P<0.05)。

表1 四組患者血清外泌體HBV DNA 載量及mir-122、mir-146a表達水平比較

表2 4組患者血清肝纖維化指標比較(ng/mL，±s)

討 論

外泌體內容物包括特性蛋白、脂質、DNA、mRNA及miRNA等多種分子，可參與細胞信號傳導、物質傳遞、血管生成、炎癥反應及免疫調節等生理病理過程。與游離性miRNA相比，外泌體源性miRNA穩定性及抗降解能力更強，在CHB及肝細胞癌診斷及靶向治療中意義重大[11-14]。

mir-122與HBV密切相關，是一種肝損傷標志性miRNA[15]。王福玲[16]研究報道，血清mir-122水平隨HBV DNA增加而升高，與HBV DNA呈正相關。Mosedale等[17]研究報道，外泌體mir-122水平在藥物性肝損傷細胞中顯著增加，與細胞程序性死亡及細胞膜通透性增加有關。Jiao等[18]研究報道，持續病毒應答組血清和外泌體mir-122-5p水平均顯著高于無應答組，mir-122-5p可作為丙型病毒性肝炎診療的生物標志。本研究結果發現，與對照組比較，HBV DNA低、中、高載量組血清外泌體mir-122表達水平均顯著增加，且與HBV DNA載量、肝纖維化指標HA、PC Ⅲ、C Ⅳ、LN水平均呈正相關。HA主要在肝內皮細胞中降解，肝臟組織受損時，對其降解能力下降，可導致血清HA水平增加。PC Ⅲ、C Ⅳ、LN是肝硬化早期指標，可反映是否肝纖維化。提示血清外泌體mir-122水平增加可能與CHB患者HBV DNA復制及肝纖維化有關，影響CHB發生發展。

mir-146a與多種慢性炎癥性疾病有關，可參與天然免疫和獲得性免疫過程，在肝臟疾病中亦發揮重要作用[7, 19]。馬宏豐和石小哲[20]研究報道，mir-146a在原發性肝癌組織及HepG2細胞中均顯著下調，過表達mir-146a可降低HepG2細胞增殖，以及其遷移及侵襲。周興宏等[21]研究報道，三七皂苷R1可通過上調mir-146a水平減輕ApoE-/-小鼠血糖血脂水平，保護小鼠肝臟炎癥損傷。本研究結果發現，血清外泌體mir-146a表達水平隨HBV DNA載量增加而降低，與mir-122、HA、PC Ⅲ、C Ⅳ、LN水平均呈負相關，提示CHB患者血清外泌體mir-146a可能與mir-122起拮抗作用，影響HBV DNA復制及肝纖維化進程，血清外泌體mir-122、mir-146a水平有可能成為CHB患者靶向治療的新型標志物。

mir-122和mir-146a參與CHB發生發展的具體炎癥相關通路尚不完全清楚，有待加大樣本量進一步深入探究。