HBsAg陽性孕產婦miR-122 rs7227488基因多態性與HBV宮內感染發生的相關性

林婧 夏霖 馮地路

孕婦HBsAg陽性是HBV宮內感染的影響因素之一，宮內感染多發生于孕晚期[1,2]。但高危孕產婦所生嬰兒個體HBV感染差異較明顯，可能與病原特征、環境暴露因素及遺傳易感性有關。miR-122是肝臟特異性miRNA，在維護肝臟正常生理過程中發揮重要作用，且與HBV載量聯系密切[3,4]。因此miR-122表達水平可能與HBsAg陽性孕產婦HBV宮內感染有關，miR-122啟動子基因多態性可能影響miR-122表達。本研究探討miR-122基因啟動子區rs7227488基因多態性與新生兒HBV感染的相關性。

資料與方法

一、一般資料

以2017年10月至2019年7月華中科技大學附屬協和醫院西院分娩的141對HBsAg陽性孕婦及其新生兒作為研究對象，所有新生兒出生24 h內接種重組酵母乙型肝炎疫苗(深圳康泰生物制品股份有限公司)及肌內注射乙肝免疫球蛋白(上海生物制品研究所有限責任公司)100 IU，出生后1、6個月分別接種乙肝疫苗各5 μg，根據新生兒出生3個月內外周血HBsAg、HBV DNA表達情況分為HBV宮內感染47例，無HBV宮內感染94例。HBV宮內感染新生兒男26例，女21例。無HBV宮內感染新生兒男51例，女43例。

二、納入及排除標準

納入標準：①孕婦HBsAg陽性；②孕產婦及其丈夫無家族遺傳病史，丈夫非HBV攜帶者；③孕產婦及其丈夫均為漢族；④單胎妊娠。排除標準：①孕產婦合并妊娠期糖尿病、高血壓；②合并全身系統性疾病；③孕產婦孕期服用抗病毒及免疫調節類藥物。本研究符合醫院倫理委員會規范；所有受試孕婦及其家屬均簽署知情同意書。

三、方法

(一)標本采集與處理 抽取孕晚期或圍生期孕產婦肘靜脈血2 mL，采集新生兒出生3個月后頸靜脈血或頭皮靜脈血1 mL，于EDTA抗凝管中，-80 ℃冰箱中保存備用。

(二)基因組DNA提取及基因多態性檢測 采用基因提取試劑盒提取(北京天根生化科技有限公司)孕產婦全血中基因組DNA，嚴格參照操作說明書進行。

(三)引物設計與PCR 利用Primer 5.0生物軟件設計miR-122基因啟動子SNP rs7227488的引物，上游引物：5′-GTTAAACTGGTTGGAAG-TTGG-3′，下游引物：5′-ATTGGAAAGTCCATTCC-TCTG-3′(上海生工生物工程有限公司合成)。PCR反應體系：上、下游引物(25 mmol/L)各0.4 μL，10×TaP Buffer 2.5 μL，4×dDNTP(2.5 mmol/L)2 μL，二甲基亞砜(DMSO)1.25 μL，TaqDNA合成酶(大連寶生物工程公司)0.2 μL，DNA模板1.5 μL，ddH2O 75 μL，單管反應體積25 μL。熱循環參數：94℃預變性5 min，94℃變形30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環35次，72℃延伸7 min。取PCR擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠( ethidium bromide，EB)染色分析，擴增產物長度為231 bp。

(四)酶切反應 采用限制性內切酶MsPI(美國Sigma公司)酶切鑒定。酶切反應體系：10×Buffer 1.5 μL，0.1×BSA 1.5 μL，MsP I 0.8 μL，PCR產物DNA 6 μL，ddH2O 5.2 μL。單管反應體積15 μL。反應條件：37℃下溫浴2 h，10×Buffer 1.5 μL后終止反應。酶切產物以3.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色分析。產物委托北京諾禾致源科技股份有限公司代為測序。

四、統計學方法

結 果

一、一般資料比較

無HBV宮內感染組與HBV宮內感染組的新生兒性別、孕產婦年齡、分娩時孕周、分娩方式、HBIG注射史等差異無統計學意義(P>0.05)，與無HBV宮內感染組相比，HBV宮內感染組HBV DNA含量升高(P<0.05)。見表1。

二、Hardy-Weinberg平衡定律檢驗

根據Hardy-Weinberg平衡定律，無HBV宮內感染組與HBV宮內感染組G/A各基因型的期望值和觀察值符合Hardy-Weinberg平衡定律(均P>0.05)，提示群體來自同一孟德爾群體，所選樣本進行群體遺傳學研究具有代表性。見表2。

表1 兩組一般資料比較

表2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果

三、miR-122啟動子rs7227488基因位點與基因分型

94例無HBV宮內感染組miR-122啟動子rs7227488位點3種基因型分別為：GG型64例(68.1%)，GA型27例(28.7%)，AA型3例(3.2%)。G等位基因頻率為155(82.4%)，A等位基因頻率為33(17.6%)。

47例HBV宮內感染組miR-122啟動子rs7227488位點3種基因型分別為：GG型21例(44.7%)，GA型17例(36.2%)，AA型9例(19.1%)。G等位基因頻率為59(62.7%)，A等位基因頻率為35(37.2%)。

與無HBV宮內感染組44.6%相比，HBV宮內感染組55.3%rs7227488位點G/A點突變率顯著升高(P<0.05)。

四、HBsAg陽性孕產婦發生HBV宮內感染危險因素分析

以HBsAg陽性孕產婦是否發生宮內感染為自變量，HBV DNA含量、miR-122啟動子rs7227488基因分型GG型、GA型、AA型為因變量進行二元logistic回歸分析，結果顯示HBV DNA含量、miR-122啟動子rs7227488位點AA型是HBsAg陽性孕產婦患者發生宮內感染的危險因素(OR：1.512、1.898，均P<0.05)。見表3。

討 論

MiR-122是一種肝臟特異性miRNA，在肝臟總miRNA中豐度最高，對肝功能具有重要調節作用，參與肝臟的發育分化，并維持肝臟正常功能[5,6]。研究顯示，miR-122可抑制肝癌細胞增殖[7]，肝癌組織中miR-122表達下降。HBV持續感染是引起肝癌的原因之一，有研究顯示，miR-122可下調HBV基因的表達[8]。荊曉晴等[9]研究顯示，HBV感染過程中，上調miR-122表達可抑制HBV復制，提示miR-122與HBV感染關系密切；其認為影響miR-122表達水平的相關因素可能與HBsAg陽性孕產婦HBV宮內感染個體易感性有關。miR-122啟動子260 bp處(rs 7227488)存在單核苷酸多態性位點(A>G)，熊玉娟等[10]研究雙熒光素酶報告基因顯示，此位點不同等位基因型對miR-122活性有影響。本研究中無HBV宮內感染組與HBV宮內感染組HBsAg陽性孕產婦miR-122 rs 7227488 G/A各基因型的期望值和觀察檢驗均符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示群體來自同一孟德爾群體，所選樣本進行群體遺傳學研究具有代表性。

表3 HBsAg陽性孕產婦發生HBV宮內感染危險因素分析

HBV宮內感染組孕婦miR-122 rs7227488 G/A突變率顯著高于無HBV宮內感染組孕婦，提示位點rs7227488 G/A突變可能與HBV宮內感染有關。但HBV宮內感染組與無HBV宮內感染組miR-122 rs7227488 GA型差異較小，而AA型差異較大，提示miR-122 rs 7227488 AA型可能是增加發生HBV宮內感染風險的原因，而GG型在無HBV宮內感染組比例高于HBV宮內感染組，提示GG型可能更多發揮抗感染作用。Caviglia等[11]研究顯示，miR-122可通過與HBV 5端非翻譯區結合，維持HBV穩定，促進HBV復制。van der Ree等[12]研究顯示，miR-122與HBV載量密切相關。以上結果均提示miR-122 rs7227488基因多態性可能通過影響miR-122表達參與HBV宮內感染的發生，但本研究未對基因型與miR-122表達關系進一步探討。經logistic回歸分析顯示，HBV DNA含量、HBsAg陽性孕產婦miR-122 rs7227488 AA基因型是發生宮內感染的危險因素。

綜上所述，HBsAg陽性孕產婦miR-122 rs7227488 AA基因型與HBV宮內感染的發生密切相關，但由于新生兒樣本量較小，因此只能推測以上幾點可能與 HBV 母嬰傳播有關，今后需進一步擴大樣本量證實以上miR-122 rs7227488是否與HBV宮內感染有確定關聯性。