血小板內皮黏附分子-1與表皮生長因子受體在乳腺浸潤性導管癌中表達的關系及意義

司惠妍，李靖若，呂思琦，李文龍，張瑩瑩

(鄭州大學第一附屬醫院 乳腺外科，河南 鄭州 450052)

如今，乳腺癌已成為威脅我國女性健康的首位惡性腫瘤，發病率連年上升，發病年齡趨于年輕化，乳腺惡性腫瘤是乳腺上皮細胞在多種因素的共同作用下異常增殖而最終形成的。對乳腺癌組織進行免疫組化檢測及分析是目前乳腺癌診療的基本步驟之一，它影響著進一步治療方案的制定以及預后的判定。臨床研究發現，血小板-內皮細胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1，又稱CD31)是相對分子質量為130 kD的免疫球蛋白超家族成員之一，主要存在于血管內皮細胞的緊密連接處，與內皮細胞的生物學功能密切相關，它參與了細胞的黏附、外滲，影響著多種信號通路的表達。另外，CD31也影響了腫瘤細胞與細胞外基質中整合素的結合，抑制乳腺癌細胞的凋亡[1]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是相對分子質量為180 kD的酪氨酸激酶受體家族成員之一，常存在于細胞膜表面，有酪氨酸激酶活性，影響細胞外信號向胞內傳遞的過程，刺激乳腺癌細胞分裂增殖[2]。近年來一些研究發現CD31和EGFR在乳腺癌組織中異常表達，但有關二者之間聯系的文獻卻很少[3-4]。本研究通過免疫組織化學方法檢測乳腺癌組織中CD31與EGFR表達情況，探討它們與乳腺癌分子分型、細胞增殖核抗原(Ki-67)的表達及其他生物學行為之間的關系，為乳腺癌的診療及判斷預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2017年10月至2019年10月間就診于鄭州大學第一附屬醫院乳腺外科原發性乳腺癌患者163例，術后病理均為乳腺浸潤性導管癌，患者均為女性，年齡為27～83歲，中位年齡為50歲。術前均未接受化療、放射治療及內分泌治療。按照美國癌癥聯合委員會于2017年發布的乳腺癌TNM分期標準，分為Ⅰ期56例，Ⅱ期95例，Ⅲ期11例，Ⅳ期1例；腫瘤直徑>2 cm有79例，≤2 cm有84例；淋巴結轉移73例，無轉移90例。參照中國臨床腫瘤協會于2019年發布的乳腺癌分子分型標準，分為Luminal A型41例，Luminal B型41例，三陰型40例，Her-2陽性型41例。Ki-67<30% 74 例，Ki-67≥30% 89例。

1.2 試劑鼠抗人CD31單克隆抗體(66065-1-Ig)、鼠抗人EGFR單克隆抗體(66455-1-Ig)均購自武漢三鷹公司，Ki-67增殖檢測試劑盒、SP超敏免疫組化試劑盒、DAB顯色劑均購自北京中山金橋生物技術有限公司。

1.3 方法163例乳腺浸潤性導管癌患者均接受手術治療，利用免疫組織化學SP染色方法檢測術中獲取的乳腺癌組織中CD31、EGFR及Ki-67表達情況。首先將標本置于中性甲醛固定，后進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，烤片。石蠟常規脫蠟水化，用PBS緩沖液沖洗3次，檸檬酸鈉抗原修復液修復，過氧化氫溶液消除內源性過氧化物酶活性，滴加正常山羊血清封閉液，室溫靜置20 min，甩去多余液體。滴加Ⅰ抗50 μL，室溫靜置1 h，滴加鼠抗人CD31抗體及鼠抗人EGFR抗體室溫下孵育30 min。進行DAB顯色8～12 min后用蒸餾水沖洗，脫水、透明、以中性樹膠封固，鏡下觀察。陰性對照以磷酸鹽緩沖液PBS代替一抗，陽性對照為同樣條件下已知的陽性切片。

1.4 結果判定CD31及EGFR陽性表達為在組織中出現棕黃色染色，即在高倍鏡(×200)下隨機取5個不同的視野，觀察染色數量及程度，CD31、EGFR染色陽性細胞數>10%為陽性表達。

1.5 統計學分析數據采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，定性資料采用χ2檢驗，相關性分析使用Spearman秩相關，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 乳腺浸潤性導管癌組織中CD31與EGFR蛋白表達及二者的關系163例乳腺癌組織中，共有91例CD31表達陽性(55.8%)，棕黃色顆粒主要定位于血管內皮的細胞質和細胞膜處，66例EGFR表達陽性(40.5%)，棕黃色顆粒主要定位于腫瘤細胞的細胞質和細胞膜。二者陽性表達呈正相關(r=0.155，P<0.05)。見圖1。

2.2 乳腺浸潤性導管癌組織中CD31、EGFR蛋白表達陽性率與臨床生物學特征的關系CD31陽性淋巴結轉移率較CD31陰性高，CD31在Ki-67≥30%、三陰型組織中陽性表達較高，差異有統計學意義(P<0.05)。EGFR蛋白在腫塊最大徑>2 cm、組織學分型Ⅲ級、Ki-67≥30%、三陰型組織中陽性表達較高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

A為CD31在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達；B為EGFR在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達；CD31為血小板內皮細胞黏附因子-1；EGFR為表皮生長因子受體。

圖1 CD31和EGFR在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達(DAB，×200) 表1 乳腺癌組織中CD31、EGFR陽性表達率與臨床生物學特征的關系[n(%)]

3 討論

乳腺腫瘤細胞的生長發育是在多種因素的共同作用下完成的，而乳腺腫瘤血管的生成是乳腺癌細胞增殖分化、復發轉移的重要影響因素之一。CD31參與并調節了血管內皮細胞的病理活動，當血小板與腫瘤細胞結合后，內皮細胞與CD31連接，促使并增強內皮細胞與乳腺腫瘤細胞的粘連[5]。另外，CD31常與其他黏附分子共同被激活，產生大量生長因子降解微血管膜，使乳腺腫瘤細胞開始浸潤并移動，乳腺癌組織周圍新生血管生成，最終促進腫瘤細胞增殖、浸潤并遷移[6]。在以往的研究中，CD31作為血管內皮標志物，可以反映前列腺癌、子宮內膜癌、胰腺癌等惡性腫瘤的生長發育，為它們確定診療方法、判斷預后做出巨大貢獻。Bergom等[7-10]研究指出，胃腸道間質瘤的增殖發展及預后與CD31表達有關。在本研究中，CD31蛋白在淋巴結有轉移、Ki-67高表達、三陰型的組織中陽性表達較高。乳腺癌的常見轉移方式有局部浸潤、淋巴結轉移、血液轉移，而淋巴結轉移在臨床中最為多見。實驗結果表明，CD31與乳腺癌腫瘤的發生發展及轉移密切相關，并且這一過程需要來自周圍新生血管的營養支持，CD31陽性表達，乳腺癌腫瘤臨床分期可能越晚。另外，既往研究顯示，三陰型乳腺癌是指雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長因子受體2均為陰性的乳腺癌，其分化程度較低，復發轉移率及惡性程度較高，患者總體存活時間較短。本研究結果提示了新生血管的形成及CD31陽性表達與乳腺癌組織的分子分型和三陰型乳腺癌的上述特點相關。

EGFR是酪氨酸激酶Ⅰ型受體家族成員之一，有酪氨酸激酶活性，主要通過基因突變或者基因擴增兩種方式激活，其活化、表達、突變對于腫瘤細胞的生長發育、變異凋亡和周圍新生血管的形成有著重要的作用[11]，EGFR蛋白表達及信號通路的增強也提示了乳腺腫瘤的預后不良[12-13]。本研究中，EGFR蛋白在較大腫塊、組織學分型較高、Ki-67高表達、三陰型組織中陽性表達率較高，說明有著酪氨酸激酶作用特點的EGFR，在乳腺癌腫瘤尤其是三陰型乳腺癌的生長發育及分化進程中起重要作用，EGFR陽性表達，腫瘤越大，分期越晚。

在本研究中，CD31和EGFR在乳腺癌組織特別是三陰型乳腺癌組織中高表達，統計學數據表明二者之間有一定的相關性，說明在乳腺浸潤性導管癌新生血管的形成及腫瘤的生發轉移過程中CD31與EGFR密不可分，互相促進，相輔相成，協同作用，但其機制還有待進一步研究。乳腺腫瘤細胞的增殖代謝、遷移轉移涉及多個基因的改變，EGFR和CD31這兩種蛋白則可作為判斷乳腺癌生長發育程度、侵襲轉移的標志物，對臨床診斷及判定預后有著重要指導作用，也可成為今后臨床治療尤其是靶向治療的新方向。