Snail基因及E-cadherin蛋白在賁門癌的表達及其臨床意義

李紀遠 馬 新 張燦斌 王 獻 鄭帥玉 王 強

河南科技大學第一附屬醫院胸外科，河南省洛陽市 471000

近二十年來，世界各地特別是美國、日本、中國和歐洲等國家胃遠側部位腫瘤發生率呈顯著下降趨勢，而賁門癌發病率卻呈明顯上升趨勢, 賁門癌發病隱蔽，分化程度低，侵襲性強，浸潤范圍廣泛，賁門癌的5年生存率只有20%～30%[1]，對人類健康威脅很大。大量的研究數據表明，賁門癌的浸潤、轉移是其主要的致死原因， 因此對其浸潤和轉移等臨床病理特征的研究很有意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集河南科技大學第一附屬醫院病理科2011—2013年間賁門癌切除標本136例，患者術前均未接受任何抗腫瘤治療，均經病理證實為腺癌。其中男86例，女50例；年齡32～73歲，中位年齡56歲。術后病理檢查有淋巴結轉移75例，無淋巴結轉移61例；高分化24例，中分化26例，低分化86例。以42例癌旁組織為參照物。

1.2 主要試劑 Snail多克隆抗體購自Abcom公司(17732)，E-cadherin多克隆抗體(ZM0092)、免疫組化SP試劑盒及DAB顯色劑均購自北京中杉生物技術有限公司，檸檬酸鹽抗原修復液購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 方法

1.3.1 載玻片的處理：將載玻片用洗滌液浸泡，清洗干凈后，過兩遍蒸餾水，晾干。再放入泡洗液(濃硫酸250ml，重鉻酸鉀100g，蒸餾水750ml)中，浸泡24h，取出載玻片，流水沖洗干凈，烘干箱內烤干載玻片。涂防脫片劑多聚賴氨酸，涂片范圍占載玻片的2/3，自然晾干備用。

1.3.2 組織標本的取材和固定：手術切除標本，取腫瘤組織約2cm×1.5cm×0.3cm大小，常規固定，石蠟包埋。

1.3.3 切片：連續切片，展開后撈片，置烤箱中70℃烤片3h。

1.3.4 免疫組織化學染色步驟：S-P試劑盒原理：采用生物素標記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化酶及底物色素混合液來測定細胞和組織切片中的抗原。染色的主要過程如下：(1)蠟切片常規脫蠟和水化。(2)每張切片滴加1滴3 %過氧化氫溶液(試劑A)，滅活內源性過氧化酶活性。(3)用PBS(pH 7.4)沖洗3次，3min/次。(4)高溫高壓組織抗原修復。(5)每張切片滴加1滴的非免疫動物血清(試劑B)，室溫孵育10min。(6)甩去血清，每張切片滴加1滴一抗體，4℃過夜。(7)用PBS(pH 7.4)沖洗3次，3min/次。(8)每張切片滴加1滴或50μl的生物素標記的二抗工作液(試劑C)，37℃溫箱孵育30min。(9)用PBS(pH 7.4)沖洗3次，3min/次。(10)每張切片滴加1滴鏈霉菌抗生物素—過氧化物酶溶液(試劑D)，37℃溫箱孵育30min。過氧化物酶使底物發生反應，于反應部位產生棕黃色沉淀物。(11)用PBS(pH 7.4)沖洗3次，3min/次。(12)每張切片滴加2滴新鮮配制的DAB，顯色3～10min。(13)沖洗，復染，分化，返藍，脫水，透明，封片。

1.4 結果判定 Snail陽性結果判定標準：以胞核出現棕黃色染色為陽性細胞，按染色強度的深淺積分，0分：無染色，1分：弱陽性，2分：強陽性。按著色細胞百分比，1分：1%～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：76%～100%。然后按照陽性細胞×染色強弱計積分，積分1～2為陰性，積分3～8為陽性。E-cadherin陽性結果判定標準：以胞膜和(或)胞質出現棕黃色染色為陽性細胞，每例切片選擇高倍視野(×100),按陽性細胞數占視野中總細胞數的百分比分為陽性與陰性：無陽性著色或陽性細胞數<25%為陰性，陽性細胞數≥25%為陽性。

1.5 統計學方法 所得數據應用SPSS13.0軟件進行統計學處理。計數資料以(%)表示，比較采用χ2檢驗，表達相關性用Spearman等級相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Snail、E-cadherin賁門癌組織及癌旁組織中的表達 136例賁門癌組織Snail陽性率72.8%,高于癌旁組織42.9%，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。Snail在癌旁組織中的表達主要見于輕中度不典型增生上皮，賁門癌組織E-cadherin的陽性率36.7%，顯著低于癌旁組織85.7%，兩者比較差異有統計學意義P<0.05)。見表1。

表1 賁門癌及癌旁組織中Snail蛋白及E-cadherin蛋白的表達

2.2 Snail與E-cadherin的表達與賁門癌浸潤、轉移以及不同分化程度的關系 侵及黏膜層組Snail的陽性表達率為29.4%，侵及肌層以上組Snail的陽性表達率為62.7%，兩者比較差異有統計學意義(P=0.02)。有淋巴結轉移組Snail在賁門癌的陽性表達率為66.7%，高于無淋巴結轉移組Snail在賁門癌的陽性表達率32.8%，兩者比較差異有統計學意義(P=0.03)，侵及黏膜層組E-cadherin的陽性表達率為79.4%，侵及肌層以上組E-cadherin的陽性表達率為52.0%，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。有淋巴結轉移組E-cadherin在賁門癌的陽性表達率為49.3%，明顯低于無淋巴結轉移組Snail在賁門癌的陽性表達率77.1%，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)，Snail的陽性表達率隨腫瘤分化程度的降低而升高，低分化組陽性率顯著高于高、中分化組(P<0.05)；E-cadherin在賁門癌中的表達隨腫瘤分化程度的降低而降低，高、中分化組陽性率相比較差異無統計學意義(P>0.05)，但陽性表達率明顯高于低分化組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 賁門癌組織中Snail蛋白表達與臨床病理學特征的關系

2.3 賁門癌組織中Snail與E-cadherin表達的關系 經Spearman等級相關分析示，隨著E-cadherin陽性表達減弱，Snail的陽性表達明顯增高，兩者在賁門癌中的表達呈負相關(r<0,P<0.05)。見表3。

表3 賁門癌組織中Snail與E-cadherin表達之間的關系

3 討論

E-cadherin又稱為L-CAM、CAM120/80、Arc-1，其基因位于人16號染色體長臂16q22.1上，表達產物是一種相對分子質量為120×103的Ca2+依賴性跨膜糖蛋白。上皮鈣黏附素E-cadherin普遍存在于各類上皮細胞，介導同型細胞連接，在維持正常上皮細胞形態、細胞極性及組織結構完整性中發揮重要作用[2]，E-cadherin介導的黏附系統的破壞，是腫瘤從非浸潤性轉化為浸潤性的關鍵步驟[3]。 E-cadherin減少、喪失，以及異質性、非極性分布使細胞間黏附力減弱，導致腫瘤細胞易于脫離原發灶而侵入到周圍組織和血管，繼而進行擴散。Kremer等[4]發現轉染野生型E-cadherin的瘤細胞生長較對照細胞慢，且腫瘤轉移灶中E-cadherin表達完全喪失。大多數實驗表明，人體惡性腫瘤細胞中E-cadherin常呈低表達。Sloan等[5]及Cheng等[6]報道E-cadherin低表達顯著與食管癌浸潤、轉移有關。這與本實驗結果基本一致。這些研究證實E-cadherin的功能明顯影響細胞的生物學行為，在賁門癌的浸潤轉移中可能起重要作用，并認為是判斷賁門癌預后的一個重要指標。

Snail是一類鋅指轉錄因子，近年來發現它的高表達與許多腫瘤的發生發展有關而備受關注，E-cadherin被認為是Snail的直接作用靶基因，轉錄因子Snail可與上皮鈣黏附因子E-cadherin啟動子區E-盒結合從而抑制E-cadherin的轉錄[7]，引起E-cadherin表達降低或缺損，從而導致上皮間連接的破壞。本實驗表明，Snail高表達于賁門癌組織中，并與浸潤轉移的發生有關。同時也證實了Snail的高表達與E-cadherin的低表達呈負相關，這在很多上皮性腫瘤(包括鱗癌、肝癌、黑色素瘤等)[8-9]中也明顯存在反向表達。

在某些胚胎發育期起重要作用的基因常常在癌組織中被發現，提示它們可能參與一些啟動腫瘤發生和促進腫瘤轉移的關鍵步驟， 其中Snail家族成員在此過程中發揮著主要作用。也就是說，在胚胎發育中Snail在上皮細胞—間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用被回憶。即Snail通過下調E-cadherin的表達進而誘導發生EMT，EMT與腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉移有著密切的關系。筆者認為，Snail使E-cadherin的表達下調，使腫瘤細胞失去黏附，從原發灶脫落分離，且與上皮性腫瘤進展過程中觸發EMT，即級聯反應的第一步有關。從而向局部浸潤、向淋巴結或遠處轉移。因此，Snail與E-cadherin的聯合檢測可作為上皮性腫瘤惡性程度及預后的參考指標，聯合檢測Snail和E-cadherin對預測賁門癌浸潤轉移有重要意義。Snail高表達和E-cadherin低表達可能是賁門黏膜惡性轉變及發生浸潤轉移的重要生物學標志。Snail和E-cadherin的表達與分化程度、臨床病理分期存在相關性，可作為判斷食管癌進展的重要標志之一。從腫瘤發生的觀點來看，這不僅對理解腫瘤的發生和轉移是重要的，同時又能充當轉移潛能的標志物，將會促進對腫瘤的個性化治療的規劃。當然，在非侵襲性腫瘤向侵襲性腫瘤發展過程存在著復雜的調控機制，并且仍有許多問題不甚明確，這些復雜的機制需要我們進一步去深入的探討和研究，希望能夠為上皮性腫瘤的診斷治療提供更有利的理論依據，這也勢必成為腫瘤侵襲、轉移機制研究的新熱點。