MMCA 技術分析廣西苗族婦女葉酸代謝通路關鍵酶基因MTHFR 677C>T、1298A>C 和MTRR 66A>G 的多態性

楊芳華 王捷 韋笑寶 石美蓮 羅世強 鐘鑫 嚴提珍（通訊作者）

（1 柳州市婦幼保健院婦女康復科 廣西 柳州 545001）

（2 融水苗族自治縣婦幼保健院 廣西 柳州 545300）

（3 柳州市婦幼保健院醫學遺傳科，柳州市出生缺陷預防與控制重點實驗室 廣西 柳州 545001）

出生缺陷嚴重危害人類的健康，其預防工作非常重要。葉酸代謝過程中亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因677C>T、1298A>C 和甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）的基因66A>G 多態性與出生缺陷發生有密切關系[1]。葉酸多態性位點的分布存在地區和種族差異性。MTHFR 和MTRR 基因單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）的分型方法主要包括限制性片段長度多態性技術、Taqman-MGB 技術、焦磷酸測序技術等。多色探針熔解曲線法（multicolor melting curve analysis，MMCA）是近幾年來新建立的基因分型技術[2]，該技術已廣泛應用于單基因遺傳病基因突變檢測和多發疾病易感SNP 分型[3]。本研究以廣西苗族女性為研究對象，采用MMCA 法對 MTHFR 677C>T、1298A>C 和MTRR 66A>G 多態性位點進行基因分型，并與其它地區不同民族的遺傳分布特征進行比較。

1.對象與方法

1.1 對象

2019 年1 月—12 月在融水婦幼保健院進行婚育檢查的苗族婦女500 例，平均年齡23.05±5.82 歲。本研究經柳州市婦幼保健院倫理委員會批準并征得被檢對象知情同意。采集口腔黏膜細胞應用MMCA 法進行檢測。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取和濃度測定

嚴格按照說明書采用柱式提取試劑盒提取樣本口腔黏膜細胞DNA，并檢測其質量和濃度（ND-1000-UV-VIS 紫外/可見光掃描分光光度計）。

1.2.2 MMCA 法進行MTRR 和MTHFR 基因分型

利用“葉酸代謝相關基因多態性檢測試劑盒（熒光PCR 熔解曲線法）”進行檢測，嚴格按照說明書進行操作。通過CFX96實時熒光PCR 儀進行檢測和結果分析。

1.3 統計學分析

應用HaploView4.2 軟件對研究人群進行MTHFR 677C>T、MTHFR 1298A>C、MTRR 66A>G 多態性位點的Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗。采用SPSS22.0 軟件對獲得數據進行統計分析，各地區各民族之間的基因型和等位基因型頻率的差異比較采用χ2檢驗。計量資料采用±s 表示，用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡分析

對廣西苗族女性MTHFR 677C>T、MTHFR 1298A>C、MTRR 66A>G 三個SNP 位點分別進行平衡檢驗，經擬合優度χ2檢驗，三個SNP 位點的基因型頻率和基因頻率處于遺傳平衡狀態（χ2分別為0.005、0.002 和3.186，P 均＞0.05），表明本研究取樣是隨機的。

2.2 苗族女性MTHFR、MTRR 基因型和等位基因頻率分布情況

500 例廣西苗族女性MTHFR 677 CC、CT、TT 的分布頻率依次為：72.2%、25.6%、2.2%；MTHFR 1298 AA、AC、CC 的基因型頻率分別為54.4%、38.6%和7.0%；MTRR 66 AA、AG、GG 的分布頻率依次為49.2%、43.4%和7.4%。MTHFR 677C>T 的C 和T 等位基因頻率分別為73.3%和26.7%，MTHFR 1298A>C 的A 和C 等位基因的頻率分別73.7%和26.3%，MTRR 66A>G 的A 和C 等位基因頻率分別為70.9%和29.1%。

2.3 不同民族女性MTHFR、MTRR 基因多態性位點基因型和等位基因頻率比較

不同民族女性MTHFR 677C>T、MTHFR 1298A>C、MTRR 66A>G 基因型及等位基因頻率比較見表1 ～3。廣西苗族MTHFR 677C>T 的基因型頻率與海南黎族[4]、新疆哈薩克族[5]、貴州土家族[6]、貴州苗族[6]、湖南土家族[7]、云南阿昌族[8]、云南傈僳族[8]、西藏藏族[9]女性比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。廣西苗族677T 等位基因頻率與海南黎族、貴州土家族、貴州苗族、湖南土家族女性比較，差異有統計學意義（P均＜0.05），與新疆哈薩克族、云南阿昌族、云南傈僳族、西藏藏族比較差異無統計學意義（P 均＞0.05）。廣西苗族MTHFR 1298A>C 的基因型頻率與貴州土家族、貴州苗族、海南黎族、湖南土家族女性比較，差異有統計學意義（P 均＜0.05），而與新疆哈薩克族、云南阿昌族、西藏藏族比較差異無統計學意義（P 均＞0.05）。廣西苗族1298C 等位基因頻率與貴州土家族、貴州苗族、湖南土家族、云南傈僳族女性比較，差異有統計學意義（P 均＜0.05），與海南黎族、新疆哈薩克族、云南阿昌族、西藏藏族差異無統計學意義（P 均＞0.05）。廣西苗族MTRR 66A>G 的基因型頻率與海南黎族、新疆哈薩克族、貴州土家族、貴州苗族、西藏藏族女性比較，差異有統計學意義（P ＜0.05），而與湖南土家族、云南阿昌族、云南傈僳族比較差異無統計學意義（P ＞0.05）。廣西苗族66G等位基因頻率與海南黎族、新疆哈薩克族、貴州土家族、貴州苗族、西藏藏族女性比較，差異有統計學意義（P ＜0.05），與湖南土家族、云南阿昌族、云南傈僳族比較差異無統計學意義（P 均＞0.05）。

表1 不同民族女性MTHFR 677C>T 基因型及等位基因頻率比較（%）

表2 不同民族女性MTHFR 1298A>C 基因型及等位基因頻率比較（%）

表3 不同民族女性MTRR 66A>G 基因型及等位基因頻率比較（%）

3.討論

2019 年柳州市圍產兒出生缺陷總發生率為14.00‰，主要類型包括先天性心臟病、多指（多趾）、外耳其他畸形、尿道下裂、并指（并趾）、唇裂、小耳、腭裂、馬蹄內翻足、直腸肛門閉鎖、胎兒水腫綜合征等。研究表明引起出生缺陷發生的因素主要包括環境因素、遺傳因素和營養因素，隨著分子遺傳學技術的發展，遺傳因素的作用顯得越來越重要。葉酸和同型半胱氨酸代謝途徑的關鍵酶是MTHFR 和MTRR，其基因多態性與出生缺陷關系密切[1]，此外，這些多態性位點在不同地區分布存在差異，與所在民族居住地的氣候、環境、飲食習慣等因素相關[7]。

本研究對廣西柳州500 例苗族女性進行了MTHFR 677C>T、MTHFR 1298A>C、MTRR 66A>G位點分布情況調查，并與海南黎族[4]、新疆哈薩克族[5]、貴州土家族[6]、貴州苗族[6]、湖南土家族[7]、云南阿昌族[8]、云南傈僳族[8]、西藏藏族[9]數據進行了比較。本文發現廣西苗族677T 等位基因頻率高于海南黎族、云南阿昌族、新疆哈薩克族，低于貴州土家族、貴州苗族、湖南土家族、云南傈僳族，不完全遵循由南到北呈現遞增趨勢，與國內已報道的其它地區和民族情況不太一致[6]，與部分亞洲國家（如約旦和印度）MTHFR 基因677T 等位基因頻率分布規律存在差異[6]，提示這種分布規律的原因可能是由紫外線照射強度和飲食習慣引發[6]。MTRR 基因66G 等位基因在少數民族中呈現由南向北逐漸遞減的趨勢，這一結果與國內學者對部分地區漢族人所做的研究結果相似[6]。基于不同地區、不同民族的遺傳特征差異[10]，在制定相關孕期保健方案時，我們需要人性化指導用藥。通過開展廣西苗族女性 MTHFR 和MTRR 基因多態性的分子流行病學研究，了解本地區少數民族人群的遺傳特征，將為當地出生缺陷一級預防和公共衛生政策提供科學依據。