不同基因型人乳頭瘤病毒感染所致尖銳濕疣皮損中p16、Akt 的表達及意義

黃尾全 王丹麗 蔣元德

( 廣東省東莞市厚街醫(yī)院 廣東 東莞 523945)

尖銳濕疣是由HPV 引起一種皮膚科常見性病，目前治療方法有藥物、激光、電灼、光動力療法等，但容易復發(fā)，給病人造成較大的困擾，本研究探討尖銳濕疣的復發(fā)與皮損部位p16,Akt的表達差異是否有關聯(lián)，以及HPV 各亞型p16,Akt 的表達是否存在差異。

1.病例收集

病例入選標準：選取2017 年9 月—2019 年12 月80 名符合中國疾病預防控制中心制訂的尖銳濕疣的診斷標準的患者，年齡18 ～52 歲，男女性別比例相同，初次發(fā)病首次就診病例。近1 月內未接受系統(tǒng)治療，2 周內未接受局部治療者。為排除其他疾病的影響，月經(jīng)期、孕婦、哺乳期女性不做為觀察對象，有生殖器部位細菌、滴蟲、真菌、感染或合并其他疾病、有全身慢性消耗性疾病或者嚴重肝腎疾病患者不做為觀察對象。所有病例均簽署知情同意書。

2.方法

2.1 HPV 基因分型檢測

2.1.1 檢測儀器及試劑 香港凱普公司的HPV 基因檢測試劑盒，美國ABI-700PCR 檢測儀。

2.1.2 HPV 分型原理及步驟 活檢取材采集CA 組織標本送本院檢驗科，由檢驗科嚴格按照試劑盒說明書進行操作，進行定量PCR 檢測分型，按HPV 分型結果分為低危型組、高危型組、高低危混合型組。

2.2 免疫組化測定組織中p16、Akt 表達

2.2.1 免疫組化 活檢取材采集CA 患者皮損標本，先用福爾馬林固定、石蠟包埋、連續(xù)切片，取健康成人包皮環(huán)切組織10 例做正常對照。切片常規(guī)脫蠟水化，3%過氧化氫甲醇溶液10min 阻斷內源性過氧化物酶，抗原修復液于微波爐中抗原修復 10min；非免疫動物血清37℃孵育10min；加入一抗4℃濕盒中過夜孵育，生物素標記的二抗37℃孵育30min，鏈霉素-過 氧化物酶（SP）復合物37℃孵育30min；DAB 顯色，蘇木精復染，脫水、透明、封片。每次實驗陽性對照參考已知陽性片，陰性對照則采用PBS 替代第一抗體。

2.2.2 免疫組化結果判定 參照Krajewska 等的評分方法分別記錄標本中表皮基底細胞層和棘細胞層的評分，弱、中、強陽性表達強度按顏色顯示為黃色、棕黃色、棕褐色分別定義，并且計為1 ～3 分；然后按陽性細胞所占的百分比將＜1%、1%～25%、26%～50%、51%～75%、＞76%記為0 ～4 分；最后綜合兩部分得分。

2.3 治療方案

①物理方法：高頻電灼祛除疣體；②肌注γ 干擾素200 萬u，隔日一次，共10 次。

2.4 預后觀察

手術后3 個月內每2 周門診復查，3 個月后改為每月門診復查，隨訪6 個月，在患者復診期間如發(fā)現(xiàn)新發(fā)CA 病灶或者醋酸白試驗陽性均視為臨床復發(fā)。

2.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0 軟件對實驗結果所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗；計量資料以（±s）表示，采用t 檢驗，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3.結果

3.1 p16、Akt 蛋白在各組中的表達，低危組Akt 表達陽性38 例，p16 陽性35 例，高危組Akt 表達陽性10 例，p16 陽性9 例，高低危混合組Akt 表達陽性13 例, p16 陽性12 例，正常對照組Akt 表達陽性2 例，p16 陽性2 例；p16、Akt 表達陽性在各組之間差異具有統(tǒng)計學意義，P ＜0.01，均高于正常對照組，見表1。

表1 各組p16、Akt 蛋白陽性率比較[n（%）]

3.2 尖銳濕疣復發(fā)組Akt、p16 的評分均高于未復發(fā)組，兩組之間差異比較具有統(tǒng)計學意義，P ＜0.01，見表2。

表2 尖銳濕疣復發(fā)組與未復發(fā)組Akt、p16 的評分情況（±s）

例數(shù)Aktp16復發(fā)組311.95±0.422.11±0.38未復發(fā)組491.31±0.361.32±0.29 t-3.927.38 P-＜0.01＜0.01

4.討論

尖銳濕疣是由人乳頭瘤病毒（HPV）引起的皮膚性病科常見性病，臨床表現(xiàn)主要為在生殖器及肛周附近的皮膚黏膜出現(xiàn)皮膚贅生物，患病率呈逐年上升的變化趨勢。有關研究統(tǒng)計有半數(shù)以上的患者在初次治療后可能會有尖銳濕疣的復發(fā)[1]。尖銳濕疣的具體復發(fā)原因目前并不明確，其可能與患者HPV潛伏感染、患者亞臨床感染、細胞過度增生和機體的免疫功能發(fā)生異常等因素相關[2]。

我們臨床上雖然治療CA 方法有很多種，包括手術、藥物、激光、冷凍、光動力療法等，但是尖銳濕疣的復發(fā)率還是較高，CA 復發(fā)的具體原因目前尚未完全闡釋清楚，CA 的易復發(fā)性可能與細胞過度增殖、HPV 感染型別、亞臨床感染和機體免疫狀態(tài)紊亂等相關聯(lián)。有文獻顯示，HPV 亞型混合感染的CA 患者復發(fā)率要高于單一亞型感染的CA 患者。并且發(fā)現(xiàn)高危型+低危型是主要引起復發(fā)的一種感染模式[3]。因此，HPV 亞型混合感染有可能是引起患者復發(fā)的重要原因之一[4]。探究其原因，我們認為，HPV 亞型混合感染可能更易造成機體局部免疫紊亂，從而干擾表皮細胞正常的生長周期，導致局部細胞凋亡不足。

p16 基因又叫MTS（multiple tumor suppressor 1）基因，負調節(jié)細胞增殖及分裂，有人把它比作細胞周期中的剎車裝置，一旦失靈則會導致細胞增殖，導致腫瘤發(fā)生[5]。在宮頸癌研究中，p16 蛋白在宮頸癌中表達量明顯升高，考慮p16 的高表達與HPV感染有關。在正常細胞周期調控過程中，p16 通過視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白（Rb 蛋白）發(fā)揮作用[6]。而在HPV 感染時，HPV 病毒基因E7 與PRb 結合，導致p16 蛋白反饋性增高，但此時p16 的生理功能卻喪失[7]。本研究發(fā)現(xiàn)p16 在高危型患者陽性率為75.0%，高低危混合型為70.5%，低危型為78.6%，正常對照組為20%，各組之間比較差異具有統(tǒng)計學意義，復發(fā)組評分2.11±0.38，未復發(fā)組評分1.32±0.29，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義，本研究發(fā)現(xiàn)尖銳濕疣的復發(fā)可能與p16 蛋白反饋性增高，失去了正常的抑制細胞生長周期的功能。

Demeter、馮進云等[8,9]研究顯示CA 皮損的表皮細胞發(fā)生比較明顯的細胞增殖，除基底細胞層外，發(fā)現(xiàn)棘層甚至顆粒層細胞均有增殖活性，而表皮細胞凋亡卻沒有相應的增加。從而容易導致皮損的復發(fā)。Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，又稱為蛋白激酶B（protein kinase，PKB）。活化的Akt 可以產生抑制細胞凋亡的作用，從而促進細胞周期運行[10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)Akt 高危型患者陽性率為83.3%，高低危混合型為76.4%，低危型為74.5，正常對照組為20%，各組之間比較差異具有統(tǒng)計學意義，說明HPV 感染Akt 表達高于正常人，而Akt 的過表達可能可以抑制細胞凋亡的發(fā)生，而且高危型和高低危混合型均高于低危型，說明這兩組患者可能更易復發(fā)，在臨床治療中應更加重視此類患者的治療，并且我們發(fā)現(xiàn)，在復發(fā)的尖銳濕疣患者中Akt 評分1.95±0.42，高于未復發(fā)組評分1.31±0.36，差異具有統(tǒng)計學意義，進一步證明了Akt可能參與了CA的臨床復發(fā)，我們推測HPV 可能通過抑制細胞凋亡，使細胞永生化，從而逃避宿主的清除，從而引起尖銳濕疣的復發(fā)。

總之，本項目研究各發(fā)現(xiàn)尖銳濕疣復發(fā)患者的Akt、p16的表達水平高于未復發(fā)者，說明尖銳濕疣的復發(fā)可能與皮損中Akt、p16 蛋白的過表達存在關聯(lián)，為臨床上尖銳濕疣起病原因、疾病轉歸、疾病的防御及治療提供更扎實的理論基礎。