卵巢癌腹水減低自然殺傷細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞相互作用

何思思 吳金枝 張大權(quán) 王彥哲 茍小霞（通訊作者）

（1 遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科 貴州 遵義 563003）

（2 遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院放療中心 貴州 遵義 563003）

卵巢癌作為全球高發(fā)的女性腫瘤之一，因其高死亡率嚴(yán)重威脅人類生命安全。約三分之二患者在確診時(shí)已處于疾病晚期[1,2]。目前針對(duì)晚期卵巢癌主要治療手段包括腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)輔以化療、放療等綜合治療，但卵巢癌具有腫瘤異質(zhì)性、高轉(zhuǎn)移率、進(jìn)展迅速等特征，且當(dāng)前治療手段中缺乏有效的維持治療，大部分患者復(fù)發(fā)時(shí)腫瘤已獲得耐藥性[3,4]，最終導(dǎo)致治療效果不佳，值得重視的是，超過三分之一的卵巢癌患者在診斷時(shí)已合并伴有腹腔積液，這也可作為腫瘤細(xì)胞腹腔轉(zhuǎn)移的重要提示[5]。近年來研究證實(shí)，卵巢癌腹水與不良預(yù)后密切相關(guān)。作為腫瘤細(xì)胞“儲(chǔ)備庫(kù)”，腹水中免疫細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)因子同時(shí)參與促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)并抑制宿主免疫系統(tǒng)的過程[6]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（T G F-β 信號(hào)）調(diào)節(jié)與漿液性卵巢癌的轉(zhuǎn)移和存活不佳相關(guān)[7]。Puiffe ML 等報(bào)道了卵巢癌腹水促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移[8]。Goncharenko-Khaider N 發(fā)現(xiàn)卵巢癌腹水通過明顯增加腫瘤細(xì)胞Mcl-1 表達(dá)進(jìn)一步通過ERK1/2-Elk-1 通路減弱TRAIL 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9]。卵巢癌腹水中成分復(fù)雜，腫瘤細(xì)胞可能發(fā)生免疫逃逸。自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，簡(jiǎn)稱NK）作為機(jī)體天然免疫的主要承擔(dān)者，主要通過抑制性殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（K I R）和活化性受體N K G2D 調(diào)節(jié)殺傷腫瘤作用，但目前對(duì)于卵巢癌腹水環(huán)境中N K 細(xì)胞殺傷功能及活化性受體狀態(tài)尚未明確。

1.材料與方法

1.1 收集本院婦科患者晚期卵巢癌腹水20 例。從健康志愿者抽取50ml 外周血液，利用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行梯度離心獲得單核細(xì)胞群；根據(jù)磁性細(xì)胞分選技術(shù)NK Cell Isolation Kit 將細(xì)胞重懸至細(xì)胞濃度為10×107/ml。將培養(yǎng)好的NK 細(xì)胞用PBS 清洗3 次，平均加入兩管10ml 玻璃管，在避光的條件下分別加入CD56 抗體，CD3 抗體，待20min 后用PBS 清洗兩次后，上機(jī)檢測(cè)。NK 細(xì)胞純化指標(biāo)：流式細(xì)胞儀檢測(cè)指標(biāo)：CD56+CD3 ≥95%。

1.2 分離出的NK 細(xì)胞使用特殊配置的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每?jī)商彀肓繐Q液，培養(yǎng)7 天后鋪板利用。培養(yǎng)48h 條件：RPMI4.5g/ml葡萄糖2mM 谷氨酰胺，10%人血清PAA，200U/ml IL-2，10ng/ml IL-15。培養(yǎng)1 周后收取細(xì)胞，棄上清，PBS 反復(fù)清洗三次將收集的細(xì)胞作下一步檢測(cè)。

1.3 取患者腹水1500g，3min,離心兩次后將細(xì)胞至于100mm 圓皿體外培，10% FBS RPMI-1640 培養(yǎng)基作為對(duì)照培養(yǎng)基。選取人卵巢癌細(xì)胞株SKVO3 傳代。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)細(xì)胞/ml 傳代培養(yǎng)。過夜貼壁后更換離心后腹水作用72 小時(shí)后，再次傳代重復(fù)上述步驟。培養(yǎng)1 周后收取細(xì)胞，棄上清，PBS 反復(fù)清洗三次將收集的細(xì)胞作下一步檢測(cè)。

1.4 制作單細(xì)胞懸液置于2ml 圓底流式管中，離心，1500g，3min，用槍尖棄上清液，在流式管加入100ul PBS，輕柔重懸；加入PBS 1ml至流式管中，反復(fù)離心洗滌2次，棄去上清，輕柔重懸。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)腹水對(duì)NK 細(xì)胞受體、CD107a、IFN-γ 變化。

2.結(jié)果

結(jié)果表明，經(jīng)過磁珠分選N K 細(xì)胞純度達(dá)到85%以上且穩(wěn)定。通過卵巢癌腹水培養(yǎng)后，流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)N K 細(xì)胞激活受體NKG2D 表達(dá)、IFN-γ 分泌及CD107a 水平受到明顯抑制。

通過對(duì)腹水培養(yǎng)后NK 細(xì)胞受體、CD107a 脫顆粒、IFN-γ水平檢測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)了卵巢癌腹水明顯降低NK 細(xì)胞NKG2D受體表達(dá)（圖1A），且IFN-γ 分泌、CD107a 表達(dá)水平降低，而對(duì)NKp44、NKp46 無影響（圖1B）。

3.討論

卵巢癌腹腔微環(huán)境中存在CD4+CD25+Treg，且其含量及免疫抑制功能較外周血PBMC 顯著增高，提示卵巢癌腹腔內(nèi)更易發(fā)生免疫逃逸作用[10]。其中自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，簡(jiǎn)稱NK）作為機(jī)體天然免疫的主要承擔(dān)者，主要通過抑制性殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（KIR）和活化性受體NKG2D 調(diào)節(jié)殺傷腫瘤作用，但目前對(duì)于卵巢癌腹水環(huán)境中NK 細(xì)胞殺傷功能及活化性受體狀態(tài)尚未明確。

NK 細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒殺傷作用的方式是通過平衡激活性受體和抑制性受體的信號(hào)。NKG2D 受體家族與NK 細(xì)胞發(fā)揮激活功能密切相關(guān)。在NK 細(xì)胞，CD8+淋巴細(xì)胞和γδT 細(xì)胞表面，NKG2D受體均有表達(dá)。激活NKG2D 受體配體可特異性識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞。盡管自然殺傷細(xì)胞具有抗腫瘤作用，但卵巢癌腹水中NK 細(xì)胞殺傷機(jī)制是否得到有效激活尚未可知。

近來研究表明，給予外周血單個(gè)核細(xì)胞聯(lián)合白介素-2 腹腔注射NSG 卵巢癌小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外周血與腹膜腔中NK 細(xì)胞明顯增殖，且NK 脫顆粒酶作用上調(diào)。這說明NK 細(xì)胞作為主要效應(yīng)細(xì)胞在腹膜腔中發(fā)揮抗腫瘤作用。另一項(xiàng)研究證實(shí)體外擴(kuò)增卵巢癌患者外周血來源及腹水來源的自然殺傷細(xì)胞對(duì)體原發(fā)性卵巢癌細(xì)胞和卵巢癌耐藥細(xì)胞株表現(xiàn)出明顯殺傷活性，這說明卵巢癌惡性腹水中的自然殺傷細(xì)胞在體外環(huán)境發(fā)揮抗腫瘤作用，但該研究未深入探究自然殺傷細(xì)胞在腹水環(huán)境中是否發(fā)揮殺傷功能。

更早期研究提示，卵巢癌腹水來源腫瘤細(xì)胞表達(dá)NK 相關(guān)的識(shí)別結(jié)構(gòu)，但是對(duì)未受刺激的效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞溶解具有相對(duì)抗性目前研究并未對(duì)卵巢癌腹水影響腫瘤與自然殺傷細(xì)胞相互作用做更深一步探究，且國(guó)內(nèi)外從基礎(chǔ)研究角度對(duì)卵巢癌腹水誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸及其機(jī)制研究尚少，開展這一研究對(duì)卵巢癌聯(lián)合治療策略研究具有重要意義。

本項(xiàng)目通過檢測(cè)腹水培養(yǎng)后腫瘤細(xì)胞與自然殺傷細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，以NKG2D 受體及配體為主的交互作用明顯收到抑制，且NK 脫顆粒作用減低，殺傷活性明顯減低。研究證實(shí)卵巢癌腹水環(huán)境中NK 細(xì)胞受到抑制主要與受體配體相互作用有關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)為小樣本實(shí)驗(yàn)，還需大樣本來進(jìn)一步驗(yàn)證。