吻鮈不同組織乳酸脫氫酶及酯酶同工酶研究

饒毅 徐先棟 王生 章海鑫 傅義龍

摘要：采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法對采自贛江上游流域的吻鮈肝臟、脾臟、肌肉、腎臟、心臟和腦6 種組織中的乳酸脫氫酶和酯酶同工酶進行了研究。結果表明，吻鮈乳酸脫氫酶同工酶共檢測到3條酶帶，在肝臟、腎臟中檢測到2條，其余組織中檢測到1條。肌肉及腦組織中表達活性最高，其次為腎臟、肝臟、腎臟，心臟中表達最弱。吻鮈酯酶同工酶共檢測到5條酶帶，腎臟中檢測到5條，肝臟中檢測到4條，肌肉中3條，脾臟中2條，心臟中1條。腎臟中表達活性最高，其次為肝臟、腦、肌肉和脾臟，心臟中表達活性最弱。由結果可見吻鮈乳酸脫氫酶及酯酶分布具有組織特異性。

關鍵詞：吻鮈;乳酸脫氫酶;酯酶;組織特異性

中圖分類號：S937 ? ? ? ?文獻標識碼：A

吻鮈（Rhinogobio typus Bleeker）屬于鯉形目、鯉科、鮈亞科、吻鮈屬，我國特有種。俗稱：秋子、長鼻白楊魚、大鼓眼、鐵桿鰍和鰍兒棒[1-2]。吻鮈為底層魚類，是一種喜棲息于透明度較高、泥沙和碎石底質的緩流河口、灣沱內的底棲魚類，一般2～3齡達到性成熟，產卵在流水灘上，浮性卵，順水沖流。主要分布于長江干流及其支流，贛江也是主要分布水系。吻鮈生長較慢，個體不大，由于其含肉率高，肉質細嫩、營養豐富，必需氨基酸和鮮味氨基酸的含量高于一般的魚類，具有較高的食用價值，深受人們喜歡，市場需求旺盛，為贛江主要捕撈經濟魚類之一。關于吻鮈的研究，主要集中在形態分類、物種分化方面以及生長和繁殖特性方面[3-5]。目前對吻鮈的種質資源研究較少，為此，本文利用聚丙烯凝膠電泳技術研究吻鮈的乳酸脫氫酶和酯酶，為吻鮈的種質資源利用提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

實驗用吻鮈采自江西省峽江縣贛江水域。魚體體長約20 cm，體重90 g左右，充氧運輸至實驗室，并在玻璃缸中充氣暫養，每天投喂飼料1次，暫養一周后，魚狀態正常，采樣實驗。

1.2 ?實驗方法

1.2.1 ?酶液提取

取吻鮈肝臟、脾臟、肌肉、腎臟、心臟和腦6 種組織少許，雙蒸水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，置于離心管中，按1∶3 （W/V）加入0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.0），首先使用消毒后的手術剪把組織剪成小塊，然后再使用電動研磨器冰浴研磨成勻漿狀。完成后于4℃下10000 r/min離心30 min，吸取上清液，-20℃儲存，盡快用于電泳分析。

1.2.2 ?電泳

采用垂直平板不連續聚丙烯酞胺凝膠電泳法，電泳系統為NuPAGE Bis-Tris蛋白預制膠套裝，包括invitrogen Mini Gel Tank 小型電泳槽，NuPAGE蛋白預制梯度凝膠（濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12%）NuPAGE LDS Sample buffer緩沖液。20 μL樣品與2 μL指示劑溴酚蘭混合一起上樣，首先使用80 V電泳至樣品壓縮成一細線并跑出濃縮膠后，調大電壓至120 V繼續進行分離膠電泳，當溴酚藍的邊緣到達凝膠底部時，停止電泳，整個電泳過程約30 min。

凝膠電泳完畢后立即取下，用雙蒸水漂洗干凈，置于染色液中于37℃染色，染色方法參照國標進行[6]，染色完成后，用雙蒸水漂洗干凈，保存于7%醋酸中。用數碼相機及伯樂（Bio-Rad）凝膠成像系統（Gel Doc XR+）拍攝同工酶圖譜。同工酶在各組織中的含量以條帶粗細及顏色深淺來表示，條帶粗、顏色深表示酶的含量高。

2 ?結果與分析

2.1 ?乳酸脫氫酶酶譜表型

吻鮈乳酸脫氫酶同工酶共檢測到3條酶帶，在肝臟、腎臟中檢測到2條，其余組織中檢測到1條（圖1）。肌肉及腦組織中表達活性最高，其次為腎臟、肝臟、心臟，脾臟中表達最弱。

2.2 ? 酯酶酶譜表型

吻鮈酯酶同工酶共檢測到5條酶帶，腎臟中檢測到5條，肝臟中檢測到4條，肌肉中3條，脾臟中2條，心臟中1條（圖2）。腎臟中表達活性最高，其次為肝臟，腦，肌肉和脾臟，心臟中表達活性最弱。

3 ?討論

（1）乳酸脫氫酶（LDH）是糖酵解過程中的關鍵酶之一，在氧氣充足的組織中，如心臟中催化乳酸脫氫氧化為丙酮酸，參與三羧酸循環[7]，在厭氧器官組織中，如肝臟、肌肉組織中催化丙酮酸還原為乳酸。研究表明，魚類LDH同工酶表達是由多基因決定的，一般由M和H蛋白亞基組成，有5種組合方式，表現為5條酶帶，分布存在明顯的組織特異性[7-8] 。吻鮈腦組織和肌肉組織中活性強，因為吻鮈生活在江河流水環境，時常保持游動狀態，與之相適應運動組織肌肉和運動控制組織腦的酶活力強。此外，本次實驗的吻鮈不同組織乳酸脫氫酶中，肌肉和腦組織中條帶表達穩定，這兩種組織可作為吻鮈種質鑒定的標志酶取樣部位。

（2）酯酶（EST）屬于水解酶類，能催化酯健水解，一般認為在硬骨魚類中EST 為單體或二聚體，由多個基因位點編碼，多態性現象普遍[9]。本研究結果也表明在吻鮈各組織中酯酶的分布具有多態性，同上述結論相似。本研究結果吻鮈中各組織酯酶表達活性也各不相同，同前人研究黃顙魚體內酯酶結果相類似[10]。吻鮈酯酶在肝臟中表達活性最強，其次為腎臟。肝臟是重要的解毒器官，主要起解毒作用的就是酯酶，吻鮈肝臟中的酯酶含量豐富，與肝臟的解毒功能是相適應的。腎臟是機體重要的排泄器官，肝臟分解的有毒有害物質通過腎臟排出體外，因而與之相適應其酯酶同工酶亦表現出活力強的酶帶。吻鮈肌肉組織功能想對單一，酶譜帶表達穩定，如本研究吻鮈肌肉組織中3條酶帶，表達穩定清晰，且具有特異性，可以作為吻鮈種質鑒定的酯酶標志酶取樣部位。

參考文獻

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[2]孫玉苗. 吻鮈屬（Rhinogobio） 魚類物種分化的研究[D]. 濟南：山東大學，2008.

[3]Wang X Z， Liu H Z. Phylogenetic relationships of the Chinese cyprinid genus Rhinogobio Bleeker （ Teleostei： Cyprinidae） based on sequences of the mitochondrial DNA control region，with comments on character adaptations[J]. Hydrobiologia， 2005，532（1）：215-220.

[4] Wang M， Liu F， Lin P， et al. Evolutionary dynamics of ecological niche in three Rhinogobio fishes from the upper Yangtze River inferred from morphological traits [J]. Ecol Evol， 2015，5 （3）：567-577.

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[7]王鏡巖，朱圣庚，徐長法. 生物化學（第三版上冊）[M]. 高等教育出版社，2002：428-429.

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[9]吳少偉，張以順，黎祖福. 云斑尖塘鱧不同組織同工酶的研究[J]. 湖北農業科學，2011，50（1）：136-139.

[10]李雅娟，趙興文，毛連菊，等. 黃顙魚幾種組織的組織蛋白與酯酶同工酶電泳分析[J]. 東北農業大學學報，2004，35（3）：342-346.