利用分子標記輔助選育抗稻瘟病粳稻新品系

何彎彎,王健康,丁成偉,胡婷婷,郭榮良,吳玉玲,徐家安,王友霜,趙軼鵬

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學研究所,江蘇 徐州 221121)

0 引言

水稻是世界上主要的糧食作物之一。由Magnaportheoryzea引起的稻瘟病對水稻生產(chǎn)造成了嚴重的災(zāi)難[1]。全球每年因稻瘟病造成的水稻產(chǎn)量損失達10%～30%,直接經(jīng)濟損失超過了70億美元,損失的糧食足以養(yǎng)活6000萬人口[2]。因此,稻瘟病已成為主要影響水稻產(chǎn)量穩(wěn)定和糧食安全的重要因素之一。在目前的水稻品種審定條例中,稻瘟病抗性是一項重要的評價性狀,多數(shù)省份要求稻瘟病抗性綜合指數(shù)達到中抗以上水平。長期實踐證明,將多個具有廣譜抗性的稻瘟病基因聚合到一個品種上,是培育持久抗病品種的有效措施之一,也是防控稻瘟病最為經(jīng)濟有效的措施。

隨著分子生物學和生物技術(shù)的迅速發(fā)展,目前已經(jīng)鑒定出110個抗稻瘟病基因[3-7],且至少有26個稻瘟病抗性基因已被克隆[3,8],這些已克隆的抗稻瘟病基因的相關(guān)分子標記相繼被開發(fā),并用于抗性基因聚合的研究或育種工作中。陳紅旗等[9]將3個抗稻瘟病基因Pi-1、Pi-2以及Pi-33通過分子標記輔助選擇聚合于水稻保持系金23B中;Jiang等[10]將抗稻瘟病基因Pi-1、Pi-2和D12導(dǎo)入水稻保持系Jin 23B中;Hittalmani等[11]通過分子標記輔助選擇,將3個稻瘟病抗性基因Pi1、Piz-5及Pita聚合到感病品種CO39中;陳學偉等[12]將Pi-d(t)1、Pib、Pi-ta2聚合于G46B中;姚姝等[13]將Pi-ta、Pi-b和Wx-mq基因聚合,選育出新品系南粳0051。鑒定結(jié)果表明,這些育成的改良品系對稻瘟病的抗性、產(chǎn)量和食味品質(zhì)均得到了顯著提高。越來越多的抗稻瘟病基因的挖掘、定位和克隆為水稻抗稻瘟病育種提供了豐富的抗性資源,同時分子標記輔助選擇技術(shù)的快速發(fā)展使得培育抗病水稻品種的周期縮短,效率提高。

Pib是第1個被成功克隆的稻瘟病抗性基因,該基因位于水稻的第2染色體長臂末端,編碼產(chǎn)物包含1251個氨基酸,含1個核苷酸結(jié)合位點(nucleotide binding site, NBS)和富含亮氨酸重復(fù)區(qū)(leucine-rich reports, LRR),并受溫度和黑暗條件的誘導(dǎo)表達[14]。該基因?qū)θ毡敬蟛糠志昃哂懈呖剐訹15],多年來在我國東北地區(qū)起到了主要抗病作用[16-17],也是目前研究最廣泛的抗病基因。楊杰等[18]對我國115份粳稻地方水稻品種進行了檢測,發(fā)現(xiàn)僅有兩個材料攜帶Pib抗病基因,這說明抗病基因Pib在我國地方品種中分布較少。Fjellstrom等[19]針對稻瘟病抗、感等位基因功能基序的差異,采用等位基因特異PCR方法設(shè)計了特異擴增Pib基因及其等位基因的功能標記。本研究利用該標記,通過含抗稻瘟病基因Pib的津稻179材料對徐稻3號進行了稻瘟病抗性改良，并通過分子標記輔助選擇技術(shù),選育出農(nóng)藝性狀優(yōu)良且稻瘟病抗性增強的4個品系。

1 材料和方法

1.1 供試材料及選育方法

供體親本:抗稻瘟病材料津稻179,含有廣譜抗稻瘟病的Pib基因。受體材料:徐稻3號,為江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學研究所自主選育并大面積推廣的國審品種,目前作為黃淮地區(qū)中熟中粳對照品種。近年來徐稻3號對稻瘟病的抗性減弱,急需改良。我們以徐稻3號為母本,以津稻179為父本,獲得雜交一代F1,分子標記檢測確認其攜帶Pib；再以徐稻3號為父本,與F1進行兩次回交,每次都保留含有Pib抗性基因的株系；再進行自交,獲得穩(wěn)定的攜帶Pib的品系,最終篩選出農(nóng)藝性狀優(yōu)良且稻瘟病抗性增強的4個品系。

1.2 稻瘟病人工接種鑒定與田間誘發(fā)鑒定及評價

1.2.1 苗瘟接種鑒定 供試菌株為2015-248A3、2016-218C、2015-335D7、139E和2015-80F1,由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供。供試材料種子經(jīng)浸泡催芽后,點播于塑料育秧盤(60 cm×30 cm×4 cm)中。每盤播8行,每行3穴,共24穴,每穴6～8株苗。每盤均播種蘇御糯作為感病對照,3次重復(fù)。當水稻幼苗長至3～4葉期時進行噴霧接種,所用孢子液濃度為5×104個孢子/mL,每個秧盤內(nèi)接種40～50 mL的孢子懸浮液[20]。在溫度為26 ℃、相對濕度為95%的恒溫保濕箱內(nèi)黑暗保溫保濕24 h，然后轉(zhuǎn)移至遮蔭苗床。苗床溫度保持在25 ℃左右,并定時噴霧保濕(白天間隔2 h噴霧1次,每次1～2 min),促使秧苗發(fā)病。在接種7～10 d后,當感病材料蘇御糯出現(xiàn)典型病斑時進行調(diào)查分析。按6級分類調(diào)查法,0～2級植株為抗病表型(R),3～5級植株為感病表型(S)[21]。

1.2.2 穗頸瘟人工接種鑒定 采用人工注射接種方法,接種稻瘟病菌的混合孢子液[22],具體操作如下:在水稻孕穗至破口期,使用注射接種的方法進行穗瘟病菌接種,所用孢子液濃度為5×104個孢子/mL,每個家系至少接種10個植株,每個植株接種3個稻穗。在水稻成熟后進行水稻穗頸瘟的抗性調(diào)查。參照江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所稻瘟病鑒定標準,0級為無病,免疫;1級為1/4以下枝梗發(fā)病或穗頸有斑點,抗病;2級為1/4以上枝梗發(fā)病或主軸中部發(fā)病,或頸部有病,但對產(chǎn)量無明顯影響,中抗;3級為主軸中部或頸部有病,對產(chǎn)量有顯著影響,感病;4級為穗頸發(fā)病造成白穗,高感[23]。

1.2.3 病圃自然誘發(fā)鑒定 在連云港贛榆的自然發(fā)病圃進行誘發(fā)鑒定。該試驗點光照少、田間濕度高,非常適于稻瘟病的發(fā)病。在田塊四周種植稻瘟病高感品種蘇御糯作為誘發(fā)品種。田間水、肥管理與一般大田相同,但在整個生育期內(nèi)不防治病害。觀察整個生育期內(nèi)水稻稻瘟病的發(fā)生情況,在成熟期調(diào)查水稻穗頸瘟的發(fā)生情況。

1.3 分子標記輔助選擇

在水稻3～4葉幼苗期取新鮮葉片,采用CTAB法提取基因組DNA。參考前人的報道,分別合成能夠擴增Pib基因的引物序列(表3)。用于PCR擴增反應(yīng)的引物由上海擎科生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20 μL,包含1.0 μmol/L的正向和反向引物各0.5 μL、10 mmol/L的dNTPs 0.5 μL、10×PCR buffer 2 μL、100～200 ng的DNA模板1 μL、5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.2 μL和ddH2O 13.3 μL。不同基因聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增的程序,除了退火溫度和延伸時間有差異外(表1),其他PCR反應(yīng)參數(shù)均為: 95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃變性40 s,退火時間40 s,延伸溫度72 ℃，共32個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)含溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳分離后,用Bio-RAD凝膠成像儀(意大利 Bio-RAD公司)拍照記錄。

1.4 農(nóng)藝性狀的考察及統(tǒng)計

參與農(nóng)藝性狀考察的株系的播種期和試驗地點與人工接種試驗相同,每個株系栽插5行，每行10株，共50株,2次重復(fù)。常規(guī)肥、水管理,記載生育期、株高、分蘗數(shù)等主要農(nóng)藝性狀；在成熟后取10株按常規(guī)方法調(diào)查其產(chǎn)量構(gòu)成性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及育成株系的稻瘟病抗性

2.1.1 苗瘟抗性鑒定結(jié)果 在2018年9月,利用5個菌株對親本材料、4個品系以及感病對照進行噴霧接菌鑒定,3次重復(fù)結(jié)果顯示,感病對照蘇御糯對5個菌株均感病,達到5級,說明發(fā)病程度較重，適合進行抗性鑒定(表1)。親本材料及4個品系對5個菌株的抗感情況如表1所示,其中株系對2015-248A3的抗性來自徐稻3號,對2016-218C、2015-335D7和2015-80F1的抗性來自津稻179；徐稻3號和津稻179對139E均表現(xiàn)為感病。

表1 親本和4個品系對苗瘟的抗性鑒定結(jié)果

2.1.2 穗頸瘟抗性鑒定結(jié)果 在2017年正季，將4個品系種成4行區(qū)，每行10株，共計40株，進行表型鑒定。稻瘟病的田間抗性鑒定以蘇御糯為感病對照,以親本津稻179為抗性對照。采用來自江蘇不同地區(qū)的6個優(yōu)勢稻瘟病生理小種混合孢子液對不同的株系進行穗頸瘟接種鑒定;將親本材料及4個品系在贛榆病圃中進行自然誘發(fā)鑒定,四周均種植蘇御糯作為誘發(fā)材料。在黃熟初期,調(diào)查親本及4個品系在人工接種和自然誘發(fā)條件下的發(fā)病情況。鑒定結(jié)果表明：蘇御糯和津稻179在人工接種條件下對穗頸瘟的抗性分別為4級和1級,在自然誘發(fā)條件下的穗頸瘟抗性分別為4級和0級,說明試驗區(qū)稻瘟病的發(fā)病較為充分,能夠有效鑒定株系在田間的抗性水平；4個品系的發(fā)病率為1%～2%,其中X13的抗性水平與抗病親本津稻179相當,表現(xiàn)為抗,而X40、X41和X42均表現(xiàn)為中抗；4個品系的抗性水平均超過了受體親本徐稻3號(表2)。說明利用Pib分子標記進行稻瘟病抗性的輔助選擇是行之有效的。

表2 親本和4個品系對穗頸瘟的抗性鑒定結(jié)果

2.2 親本及育成株系的抗稻瘟病基因的檢測

在分蘗盛期,利用分子標記檢測親本材料及株系所含的抗稻瘟病基因Pib,Pib基因的擴增引物如表3所示；當擴增產(chǎn)物片段大小為365 bp時為抗性基因Pi-b；當擴增片段大小為803 bp時為感病等位基因pi-b。PCR結(jié)果如圖1所示,4個品系及親本津稻179都含有抗病基因Pi-b,而徐稻3號含有感病等位基因pi-b。

M: marker;1:徐稻3號;2:X13;3:X40;4:X41;5:X46;6:津稻179。圖1 親本及育成品系Pib基因的分子檢測結(jié)果

表3 用于PCR反應(yīng)的引物名稱、序列及預(yù)期片段長度

2.3 親本及育成品系的農(nóng)藝性狀考察結(jié)果

利用徐稻3號與津稻179進行雜交,獲得F1；在F1中去除假雜種后與徐稻3號回交。獲得的后代通過分子標記檢測選擇攜帶Pib基因的個體,連續(xù)自交5代后獲得遺傳穩(wěn)定、株型偏向徐稻3號且攜帶Pib基因的4個品系。將4個品系及親本材料種成小區(qū),每個小區(qū)40株,隨機選取10株進行農(nóng)藝性狀考察。從表4可以看出：4個品系在株高、每穗總粒數(shù)上與徐稻3號存在極顯著差異；在千粒重上與徐稻3號存在顯著差異。

表4 親本及育成株系的農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量性狀

3 討論

3.1 分子標記輔助選擇在育種中的應(yīng)用

近年來,我國各級品審和管理部門對水稻稻瘟病抗性低的品種(系)實行淘汰制,新審定的品種均要達到中抗以上水平[26]。隨著稻瘟病暴發(fā)帶來的產(chǎn)量和經(jīng)濟損失,抗稻瘟病品種的選育與種植是控制稻瘟病最經(jīng)濟、安全、有效的途徑[24-25]。分子標記輔助選擇技術(shù)可在水稻的整個生育期進行目標基因鑒定,從而顯著提高了目標性狀的選擇效率。利用與抗稻瘟病基因緊密連鎖的分子標記或功能標記選育抗病品種或品系具有周期短、成效快、目標性強等優(yōu)點。本研究以改良徐稻3號的稻瘟病抗性為重點,以攜帶抗稻瘟病基因Pib的材料津稻179為供體親本,結(jié)合分子標記輔助選擇與人工接種稻瘟病菌株技術(shù),盡可能地排除由稻瘟病菌小種的遺傳復(fù)雜性及致病力的易變性引起的不確定性因素,確保抗病基因選擇的準確性,將MAS技術(shù)與系譜選育方法相結(jié)合,通過抗病性鑒定和農(nóng)藝性狀選擇,最終獲得了抗稻瘟病的新品系。

3.2 抗稻瘟病基因Pib的應(yīng)用

抗稻瘟病基因Pib是個主效基因,能成功應(yīng)用于稻瘟病抗性品種的選育。本實驗利用Pibdom和Lys145兩個標記檢測抗稻瘟病基因Pib和感病等位基因pib,能夠直接確定純合的抗病基因Pib材料。本實驗將常規(guī)雜交育種技術(shù)與分子標記輔助選擇相結(jié)合,在整個抗稻瘟病基因篩選育種過程中對每一代都進行嚴格篩選,且只挑選高抗稻瘟病的植株,通過田間抗性鑒定及人工接種鑒定來驗證所選擇標記的準確性,同時注重農(nóng)藝性狀的選擇。通過結(jié)合MAS技術(shù)和人工接種稻瘟病的方法,可以將Pib基因轉(zhuǎn)入到水稻品種中,從而產(chǎn)生抗性；然后聚合其他的抗病基因,產(chǎn)生持久抗性,可以最大程度地延長優(yōu)良品種的使用年限。