反芻動物瘤胃微生物區系研究進展

楊 艷，瞿明仁，歐陽克蕙，婁佑武，甘興華，饒 輝，王榮民，顧 瑤，江 航

(1.江西省畜牧技術推廣站，江西 南昌 330046；2.江西農業大學 動物科技學院，江西 南昌 330045)

瘤胃微生物對反芻動物生產具有重要的影響。它能使反芻動物能夠利用發酵植物性蛋白、多糖以及纖維素等，以產生動物機體維持生長所必需的能量與養分[1,2]；另一方面，在瘤胃中進行的大量復雜的代謝過程中產生的各種代謝物也被微生物用于自身的增殖[3]。因此，開展對瘤胃微生物的研究，對指導生產實踐具有重要意義。

1 瘤胃微生物區系的組成

1.1 瘤胃細菌

細菌是瘤胃微生物中含量最為豐富、多樣，代謝最為活躍的一類。瘤胃細菌根據功能大體可以劃分為成纖維降解菌、半纖維降解菌、淀粉降解菌、糖類分解菌、利用酸菌、蛋白分解菌、產甲烷菌、脂肪分解菌等。瘤胃細菌革蘭氏陰性菌占大多數，但是革蘭氏陽性菌在高能量日糧飼喂條件下有增加的趨勢。瘤胃內的纖維降解菌的數量最大，主要包括了瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌、產琥珀酸絲狀桿菌、梭菌等。研究者們通過電子顯微鏡[4]以及定量 PCR技術[5]發現瘤胃球菌、產琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)作為瘤胃內主要的纖維降解菌在纖維的降解過程中最為重要，分泌的纖維素酶活性最高[6]。在飼喂高比例淀粉含量的日糧時，瘤胃淀粉降解菌的比例將增加。淀粉降解菌主要包括牛鏈球菌、嗜淀粉瘤胃桿菌、棲瘤胃普雷沃氏菌及反芻獸新月型單胞菌。瘤胃內功能細菌大多數具有特定的蛋白酶活性，瘤胃嗜淀粉菌是目前已知的活性最高的瘤胃蛋白分解菌；具有較高的蛋白質降解活性的還有棲普雷沃氏菌(Prevotella)、反芻獸新月型單胞菌(Selenomonasruminantium)、牛鏈球菌(Streptococcusbovis)。乳酸利用細菌包括新月形單胞菌(Selenomonas)、埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)以及向堿性韋榮氏球菌(Veillonella)。目前研究認為瘤胃細菌中產乳酸較多的是乳酸桿菌(Lactobacillus)和牛鏈球菌。

瘤胃微生物主要存在于瘤胃液、瘤胃內容物及瘤胃上皮上附著。瘤胃液內的細菌又稱液相細菌，屬嚴格厭氧細菌，最易獲得且研究較多。瘤胃內容物細菌是指定植附著于固態飼料顆粒上面的細菌，又稱固相細菌，其通過附著固相底物而分泌產生酶并將附著的底物消化降解從而獲取養分。固相細菌中包含著大量能分解利用纖維的纖維降解菌，產生較液相細菌數量更多的多糖酶，并且總酶活是液相的100倍之多[7]，所以瘤胃固相細菌是降解纖維素的最重要的組成成分。在研究荷斯坦奶牛瘤胃液相與固相中的細菌菌群結構中發現，液、固相細菌結構差異相差較大，其中低鳥嘌呤和胞嘧啶含量的革蘭氏陽性菌在瘤胃液相中的比例為52.4%，在瘤胃固相中的比例為71.4%[8]。

1.2 瘤胃原蟲和真菌

瘤胃內原蟲的含量低于細菌，其個體較大，纖毛蟲是原蟲中個體最大、數量最多的。徐淮白山羊瘤胃中原蟲密度為2.26×105個/mL，占瘤胃微生物量的44.83%[9]。瘤胃內原蟲會吞食淀粉、脂肪，從而保障瘤胃pH值穩定在固定的范圍內，對維持微生物生態系統的平衡起到一定積極的作用[10]；并會分泌纖維水解酶，降解植物細胞壁[10]，使得瘤胃干物質降解率[11]、蛋白質降解率、酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維的降解率[12]得到大幅度提高。目前發現的瘤胃真菌劃分為6個菌屬18種，分為Anaeromyces、Orpinmyces和Cyllamyces的多中心菌體，Neocallimastix、Piromyces和Caecomyces的單中心菌體。前人從飼喂青干草的山羊瘤胃液中分離到四類厭氧真菌，分屬于Orpinomyces、Anaeromyces、Piromyces和Neocallimastic[13]。反芻動物瘤胃內降解日糧中木質纖維素最有效的一類微生物類群是瘤胃內的厭氧真菌[14]。

2 影響瘤胃微生物區系結構的因素

2.1 宿主

宿主是影響反芻動物瘤胃微生物區系結構的最重要的因素之一。宿主不同，其瘤胃內的微生物種類、數量均不相同。比較分析魯西肉牛、荷斯坦奶牛、晉南牛、黃牛、牦牛以及Hanwoo的9個16SrDNA文庫組成及序列多樣性發現：魯西肉牛瘤胃細菌文庫中的91%克隆來自未培養細菌，擬桿菌和梭菌為優勢菌群；采食不同日糧的荷斯坦奶牛個體間的16SrDNA文庫組成差異不明顯，但與亞洲品種如黃牛、魯西牛的16SrDNA文庫組成的差異較顯著[15]。對比沼澤型水牛、大額牛瘤胃中、荷斯坦牛的16sRNA基因序列后發現，溶纖維丁酸弧菌僅在大額牛和水牛中發現，雙孢梭菌、硫氧化細菌、略紫色梭菌等細菌僅在水牛中發現，生黃瘤胃球菌僅存在于水牛與荷斯坦牛中，3個品種均有瘤胃解琥珀酸菌和瘤胃假丁酸弧菌[16]。在相同日糧飼養條件下，水牛的黃色瘤胃球菌和厭氧真菌數量低于印度家牛，纖維素降解菌數量高于印度家牛[17]。云南大額牛對高纖維粗料的消化能力明顯高于本地黃牛，其主要原因是云南大額牛瘤胃中纖維素降解菌比本地黃牛多，并且含有大量的毛螺菌等[18]。研究比較荷斯坦奶牛、波爾山羊、梅花鹿的細菌菌群結構時發現：荷斯坦奶牛的優勢菌為Pseudobutyrivibrioruminis(假丁酸弧菌)、Eubacteriumruminantium(反芻真桿菌)；波爾山羊的優勢菌為Clostridium(梭菌屬)；梅花鹿的優勢菌為Prevotella(普雷沃氏菌屬)、Succinivibriodextrinosolvens(溶糊精琥珀酸弧菌)[19]。當飼喂同一日糧時，綿羊瘤胃內的原蟲數量顯著低于山羊[20]。山羊家畜亞科(Caprahircus)和阿爾卑斯野山羊(Caprapyrenaicahispanica)兩個品種的瘤胃原蟲多樣性研究結果表明，原蟲多樣性在兩個山羊種屬內的差異小于種屬間的差異[21]。

2.2 生理階段

反芻動物從出生到2歲期間瘤胃微生物區系有較大變化。瘤胃為厭氧環境，其中的細菌是厭氧菌。但在幼齡時，瘤胃的微生物不完全是厭氧的。通過體外培養發現，反芻動物在幼齡階段，其瘤胃微生物區系含有兼性厭氧菌與需氧菌；但隨著日齡的增長，瘤胃發酵功能的日趨成熟，厭氧菌完全替代了這類菌群[22-24]。在成年的反芻動物瘤胃微生物中，細菌結構組成從門水平上分析，主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門[25,26]。成熟反芻動物瘤胃微生物區系結構較穩定，而幼齡期瘤胃微生物區系隨著出生后時間的延長會有數量和種類上的明顯變化。8～10月齡犢牛瘤胃微生物區系檢測到2095個細菌的操作分類單元(OTU)，分屬于24個細菌門類，其中57.2%的OTU屬擬桿菌門，26.8%的OTU屬厚壁菌門[27]。但7～63日齡的犢牛瘤胃微生物區系中細菌的OTU只有1588個，能檢測到的只有 23 個細菌門類[28]。具體到細菌種類上，對初生犢牛的瘤胃微生物區系使用實時熒光PCR技術研究發現，變形菌門在出生后第1～3天時占比極高，甚至超過厚壁菌門和擬桿菌門，但是隨著時間的推移，變形菌門所占比例也在逐漸減少[23]。在研究瘤胃細菌種群結構中發現，擬桿菌門在動物出生第3天時成為了占比例最高的菌門，在83日齡前最高時甚至可以占到 62.1%[29]。上述研究證實了瘤胃微生物區系在一定程度上也受年齡(日齡)因素的影響。

2.3 日糧

前人針對不同品種及飼喂日糧類型對瘤胃微生物菌群變化的影響做了相關研究，發現日糧因素對瘤胃菌群的影響比品種因素方面要更為顯著[30-31]。在對飼喂不同精粗比日糧的8～10月齡的荷斯坦奶牛開展的瘤胃微生物區系研究結果表明，擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門的豐度較高，平均豐度分別為57.2%、26.8%和10.3%左右，并且隨著精料水平的提高，Fibrobacteres的豐度逐漸下降。利用16SrRNA測序技術測定高牧草組和高精料組的牦牛細菌菌群結構，發現高牧草組的BacteroidalesBS11，PrevotellaceaeUCG-003，RuminococcaceaeUCG-011，BacteroidalesRF16和RuminococcaceaeUCG-010的豐度高于高精料組，而BacteroidalesS24-7、RuminococcaceaeNK4A214、Succiniclasticum以及Ruminococcus2的相對比例低于高精料組[32]。日糧類型對瘤胃真菌Neocallimastigalesassemblages有較大的影響[33]。同時，一些研究也指出在日糧中添加大蒜油[34]、豆油胡、麻油[35]等植物油以及莫能霉素、維吉尼亞霉素等抗生素[36]、益生菌酵母等微生態制劑[37]以及硫胺素等維生素[38]均能在一定程度上影響瘤胃細菌菌群結構，從而達到調控瘤胃發酵模式的目的。同時，也有研究指出在日糧中添加煙酸后提高了瘤胃的原蟲數量和密度，促進了原蟲生長[11,39]，特別是提高了纖毛蟲的數量[11]。

2.4 定植部位

研究發現羊瘤胃內微生物在液相與固相中的分布存在明顯的差異[40]。在飼用全價混合日糧的奶牛瘤胃中，液相的棲瘤胃普氏菌(Prevotellaruminicola)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)、牛鏈球菌(Streptococcusbovis)的比例較高，而在固相中白色瘤胃球菌(Rumincoccusalbus)、產琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)、反芻真桿菌(Eubacteriumruminantium)的比例較高[41]。在肉牛瘤胃微生物研究中發現，飼用粗飼料日糧為主的肉牛瘤胃解琥珀酸弧菌(Succiniclasticum)和Paludibacter在液相的比例比固相中的高，而普氏菌屬和螺旋體屬在固相的比例比液相高，分布在瘤胃固相內容物上的分解纖維類的微生物比例要比液相的高。反芻動物在飼喂粗飼料和混合粗飼料的瘤胃上皮微生物區系的相似性較高，而飼喂高比例精料日糧的瘤胃上皮微生物區系的相似性較低[42]。在瘤胃上皮細菌中厚壁菌門為優勢菌，且上皮微生物區系結構比固相、液相微生物的結構更加穩定[43]。

3 瘤胃微生物菌群研究方法進展

瘤胃微生物群落是最復雜的生物體系之一，有著豐富的基因資源和生態資源。傳統的瘤胃微生物研究的前提是必須通過體外培養獲得目的菌株，才能對其性質等進行描述研究。但瘤胃微生物的自然生長環境復雜并且嚴格厭氧，導致瘤胃細菌不到20%的種類可以體外培養[43]，而80%以上的種類無法開展研究，且體外培養不能完全模擬瘤胃微生物所處的瘤胃微生物共生的真實環境，所以傳統的研究方法的局限性限制了人們對瘤胃微生物的生態功能研究。直到20世紀80年代后，人們開始利用分子生物學技術通過瘤胃微生物的遺傳物質DNA對其功能及多樣性方面進行了研究[44,45]。利用分子生物學技術，可以直接對微生物的DNA或者RNA序列進行分析，從而極大地促進了對瘤胃內未培養微生物的研究。1993年Krumholz等利用分析核糖體RNA小亞基基因序列，將體外培養從未獲得的瘤胃細菌卵狀奎因氏菌成功地做了分類確定[46]。早期采用分子生物學技術開展瘤胃微生物研究的方法主要有單鏈構象多態性(SSCP)、限制性片段長度多態性(T-RFLP)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、熒光原位雜交(FISH)、Real-time PCR等。這些技術方法雖反映出了瘤胃微生物菌群結構組成的信息，但由于存在分辨識別度不高等缺點，所以也不能全面反映出瘤胃微生物多樣性，通過此類方法獲得的微生物信息量明顯少于實際情況[47]。隨著分子生物學的進步，1998年由Handelsman等提出的宏基因組學近年來在研究瘤胃微生物方面表現出明顯的優勢。它可以繞過培養未能培養的微生物這一技術局限，并且能研究特定環境中可培養的和未培養的全部微生物信息的總和[48]。早期的宏基因組學主要是直接提取特定環境中的總DNA，克隆到可培養的宿主細胞，通過重組克隆子的序列和功能分析挖掘出那些未能培養的微生物信息。Daniel等[49]和Ufarte等[50]對文庫構建方法和功能篩選作了詳細介紹。研究者們已經將宏基因組學的技術成功應用到瘤胃、土壤等特定環境中的纖維素酶[51]和脂酶[52]的研究中。隨著二代測序技術的興起，擴增子以及全基因組測序是宏基因組學的兩個主要的研究方向。擴增子測序技術主要用于開展特定環境下微生物群落區系的結構和豐度等信息的研究，全基因組測序則主要用于開展微生物群落功能的研究。應用Roche454 FLX或Illumina MiSeq等測序平臺對微生物宏基因組的16S/18S小亞基rRNA或DNA序列進行測序，將讀出的序列除雜優化后，用Mothur或QIIME生成可操作分類單元OTU，從各OTU中挑選1條代表性序列與微生物數據庫(SILVA、Greengenes、RDP)進行比對分析，可以得到該特定環境中的物種分類及豐度信息[53]。2014年Roggenbuck等采用Roche454 FLX測序發現長頸鹿瘤胃微生物中有20%的細菌序列為首次發現，且瘤胃固液相優勢菌均為Firmicute、Bacteridetes菌門[54]。研究者們采用擴增子測序技術對牛的瘤胃微生物多樣性的研究還發現個體對細菌的多樣性有較大影響，并指出不同的個體中僅51%的細菌分類是相似的[55]。

擴增子測序技術主要用于研究微生物群落結構，而無法滿足微生物功能研究的要求。但近年來基于擴增子測序的PICRUSt功能預測分析開始發展起來，與宏基因組研究相比，PICRUSt功能預測分析研究成本更低，同時預測的效果可靠性較高，因而開始被研究者們關注并采用[56]。目前該方法已在土壤細菌功能研究中得到應用，為細菌功能研究提供了更多可靠信息[57-59]。