HPLC法測定乳粉及乳制品中酪蛋白磷酸肽含量

曾鳳澤*，姚宇澤

1. 烏蘭察布醫學高等?？茖W校（烏蘭察布 012000）；2. 烏蘭察布市獸藥監察所（烏蘭察布 012000）

酪蛋白磷酸肽（CPP），又名促鈣吸收因子，是以牛乳或酪蛋白制品為原料，用蛋白酶水解、精制、純化而生產制得的，含有1～6個磷酸絲氨酸殘基的生物活性肽[1-3]，具有促進鈣、鐵、鋅等礦物元素吸收、預防齲齒、提高免疫力、促使惡性細胞凋亡等作用[4-6]，已被國家衛計委批準作為食品營養強化劑，食品安全國家標準GB 14880允許CPP用于調制乳、風味發酵乳、糧食和糧食制品、飲料等，使用量≤1.6 g/kg。

國內外關于CPP的檢測方法主要有鋇-乙醇沉淀法[7-8]、等電聚焦電泳（IEF）法[9-10]、液相色譜-質譜（LC-MS）法[11]、高效液相色譜（HPLC）法[12-16]，這些方法均有局限性，其中鋇-乙醇沉淀法專屬性較差，不可用于直接測定食品中CPP含量；IEF操作要求高、兩性電解質較貴；LC-MS設備昂貴，檢測成本高，且CPP無固定分子量，質譜對其監測難度大；HPLC具有操作方便、檢測成本低、靈敏度高等特點，被用于CPP產品的含量測定，而關于乳及乳制品中CPP含量的測定較少。試驗采用等電點沉淀蛋白，固相萃取柱MCX凈化，以乙腈-0.1%乙酸溶液為流動相，經ZORBAX SB-C18色譜柱梯度洗脫，采用二極管陣列檢測器測定，建立HPLC法測定乳粉及乳制品中CPP含量，為食品中CPP的含量測定提供簡便、高效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀，配備二極管陣列檢測器（DAD）（美國Agilent公司）；ME204E型電子分析天平（梅特勒托利多公司）；KQ-250B超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Vortex-genie2型渦旋混合器（美國Scientific Industries公司）；TTLDC氮吹儀（北京同泰聯科技發展有限公司）；PHS-3G型pH酸度計（梅特勒托利多公司）；固相萃取柱MCX（60 mg/3 mL，美國Waters公司）；Milli-Q型超純水器（美國Millipore公司）。

酪蛋白磷酸肽（純度98%，廣州綠翠生物科技有限公司）；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純）；氨水、鹽酸、乙酸（均為分析純）；超純水。

CPP標準儲備液（1 000 mg/L）：準確稱取250 mg（精度至0.1 mg）CPP（經折算后的標準品），用超純水溶解并定容至250 mL棕色容量瓶中，4 ℃貯存。

1.2 色譜條件

ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動相A乙腈，流動相B 0.1%乙酸溶液，梯度洗脫；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長280 nm；梯度洗脫程序見表1。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

準確稱取2.0 g（精度至0.1 mg）粉碎均勻的樣品置于100 mL燒杯中，加入20 mL超純水（40～50 ℃）溶解，超聲10 min，用1.0 mol/L鹽酸調節溶液酸度pH 4.5±0.1，定容于50 mL容量瓶中，混勻后待凈化。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.3.2 凈化

固相萃取柱MCX依次用3 mL甲醇和3 mL超純水活化后，取10 mL待凈化液過柱（控制流速1滴/3～4 s），依次用超純水和甲醇各3 mL淋洗，用5 mL 5%氨化甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，40 ℃氮吹濃縮近干，用1 mL超純水溶解殘渣，過0.45 μm微孔濾膜，濾液供HPLC分析。

1.4 標準曲線的建立

分別準確吸取適量CPP標準儲備液（1 000 mg/L），用超純水定容依次配制質量濃度5.0，10.0，50.0，100.0和200.0 μg/mL CPP標準工作液，采用高效液相色譜儀測定，以CPP質量濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

為使被測CPP波峰明顯，有較好的靈敏度，對CPP標準儲備液在190～400 nm進行紫外吸收峰掃描，結果顯示：CPP在220 nm和280 nm均有較強吸收，但選擇220 nm作為檢測波長時，容易受到乳粉及乳制品或流動相等基質的干擾；選擇280 nm作為檢測波長時，CPP色譜峰峰型對稱、峰面積較高、保留時間適中，且可有效提高乳粉及乳制品等復雜基質樣品中共提取干擾物與CPP在色譜柱中分離度和檢測特異性。因此選擇280 nm作為檢測波長。

2.2 色譜柱的選擇

以色譜柱中CPP的峰面積、保留時間、分離度為評估指標，考察Zorbax SB C18、Agilent Eclipse C18、Diamonsil C18、Shim-pack VP ODS C18、Acclaim 120 C18等色譜柱對乳粉及乳制品中CPP的分離效果（表2）。結果顯示，在相同條件下采用ZORBAX SB-C18色譜柱時，CPP色譜峰峰型對稱、保留時間適中，CPP可與雜質干擾峰有效分離，且雜質干擾峰較少，可有效提高乳粉類基質復雜樣品中共提取干擾物與CPP在C18柱中的分離度，提高CPP檢測準確性。因此選擇ZORBAX SB-C18作為分析柱。

2.3 流動相的選擇

為了達到CPP與雜峰分離的目的，縮短分析時間，分析甲醇/乙腈-水、甲醇/乙腈-乙酸銨、甲醇/乙腈-乙酸、甲醇/乙腈-十二烷基硫酸鈉等流動相對乳粉及乳制品中CPP的分離效果。結果表明，以乙腈-0.1%乙酸溶液為流動相時，CPP可與雜質干擾峰有效分離，且目標峰峰型尖銳對稱；從圖1～圖3中可知，CPP目標峰與樣品中雜峰分離度較大。因此選擇乙腈-0.1%乙酸溶液為流動相。

表2 不同色譜柱對CPP的分離效果

圖1 CPP標準溶液的液相色譜圖

圖2 實際樣品的液相色譜圖

圖3 加標樣品的液相色譜圖

2.4 蛋白沉淀劑的選擇

乳粉基質相對比較復雜，尤其是蛋白質含量較高，需將蛋白質去除以降低干擾組分。通過采用1.0 mol/L鹽酸溶液、0.1%乙酸水和10 g/L三氯乙酸溶液調節pH，考察等電點沉淀蛋白方式對乳粉及乳制品中CPP的凈化提取效果。結果表明，通過0.1%乙酸和10 g/L三氯乙酸調節溶液pH方式獲得的雜峰比1.0 mol/L鹽酸多，且雜峰會干擾CPP目標峰。因此選擇1.0 mol/L鹽酸作為蛋白沉淀劑。

2.5 固相萃取柱的選擇

由于乳粉及乳制品中含有豐富的蛋白、脂肪和磷脂（包括卵磷脂、腦磷脂和神經磷脂），為減少樣品基質對色譜柱的污染，延長色譜柱壽命，分析C18、C8、MCX、SCX、HLB、WCX等不同填料固相萃取柱對乳粉及乳制品中CPP的凈化回收率效果（圖4）。結果表明，HLB、C18和C8柱凈化效率和靈敏度較高，但易洗脫出較多雜質干擾峰，降低檢測特異性；SCX柱凈化回收效率低，凈化效果不甚理想；MCX和WCX柱對CPP的保留能力較強，凈化回收率較高，尤其是MCX柱的凈化回收率高達98.6%，且洗脫后雜質峰較少，凈化效果更佳。因此選擇MCX作為固相萃取柱。

圖4 不同固相萃取柱對CPP凈化回收率的影響

2.6 線性范圍、檢出限與定量限

按建立的HPLC法，對CPP標準溶液系列進行測定，以CPP質量濃度（x）為橫坐標，色譜峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線，建立線性回歸方程。結果表明，CPP在5.0～200.0 μg/mL范圍內，CPP質量濃度與其峰面積之間具有良好線性關系，其回歸方程為y=421.3x-318.2，相關系數（r）=0.999 7。對添加低濃度CPP標準溶液的空白試樣進行HPLC測定，以3倍信噪比和10倍信噪比分別為檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結果表明，稱樣量2 g時，乳粉及乳制品中CPP的LOD和LOQ分別為1.5和5.0 mg/kg。

2.7 回收率與精密度

選擇具有代表性的牛奶粉、羊奶粉、奶鈣片及液體奶4種樣品，每種樣品中分別加入質量濃度5.0，100.0和200.0 mg/kg的CPP標準物質，按試驗建立的HPLC法重復測定6次，計算加標回收率和相對標準偏差（RSD）。從表3可知，CPP在5.0～200.0 mg/kg加標濃度范圍內，加標回收率在86.9%～98.4%之間，RSD為1.2%～5.6%，表明方法準確度高、精密度好。

2.8 實際樣品的測定

采集國內市場銷售乳粉及乳制品，各15份，按建立的HPLC法測定實際樣品中CPP含量。結果顯示，15份乳粉均檢出含有CPP成分，含量在21.4～126.3 mg/kg之間，若以CPP含量作為評價乳粉質量指標，該批乳粉質量較高，可促進人體對鈣、鐵、鋅等礦物元素吸收，具有預防齲齒、提高免疫力等功效；15份乳制品中，7份乳制品中未檢出CPP成分，這可能是由于乳制品在生產加工過程中添加的原料乳粉含量較少或未添加乳粉，從而引起乳制品中未檢出CPP含量。因此，為保障消費者合法權益，應加強乳粉及乳制品中CPP含量的檢驗檢測。

表3 回收率和精密度（n=6）

3 結論

試驗采用等電點沉淀蛋白，MCX固相萃取柱凈化，以乙腈-0.1%乙酸溶液為流動相，經ZORBAX SBC18色譜柱梯度洗脫，二極管陣列檢測器測定，建立高效液相色譜測定乳粉及乳制品中CPP含量的檢測方法。結果顯示，在5.0～200.0 μg/mL范圍內，CPP質量濃度與其峰面積之間具有良好線性關系，r=0.999 7；LOD為1.5 mg/kg，LOQ為5.0 mg/kg；加標回收率在86.9%～98.4%之間，RSD為1.2%～5.6%。方法具有準確度高、精密度好、檢出限低、操作簡便等特點，可為乳粉及乳制品中CPP含量的測定提供測定方法。