miR-181及miR-146家族在不同甲狀腺癌細胞株中的表達及與BRAFV600E基因突變的關系

田延鋒，李 芳，張 杰，胡毅平，劉 擘，姜 霞，李冬蘊

甲狀腺癌是內分泌系統最常見的惡性腫瘤。大量研究表明，miRNA能扮演癌基因或抑癌基因的角色，其表達失調在腫瘤的發生與轉移過程中發揮著重要作用[1]，其在甲狀腺癌中的研究也受到關注。既往研究表明，miR-146b及miR-181均與甲狀腺癌患者的BRAF基因突變有關[2]，但miR-146b及miR-181家族其他成員的相關研究鮮有報道。本研究采用實時定量PCR(qRT-PCR)法，以U6為內參，通過檢測不同甲狀腺癌細胞中miR-146及miR-181家族各成員的表達及與BRAFV600E突變的相關性，初步探討miR-146及miR-181家族各成員在甲狀腺癌發生、發展過程中的作用及對甲狀腺癌早期診斷及預后判斷的意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞與培養：甲狀腺癌細胞株BCPAP細胞(BRAFV600E基因突變)購于廣州吉妮歐生物科技有限公司，甲狀腺癌細胞株TPC-1細胞(無BRAFV600E基因突變)購于上海銳賽生物技術有限公司。2種細胞的培養條件：DMEM培養基(Gibco公司)，10%胎牛血清(Gibco公司)，1% P/S，1% GLn，37℃，5% CO2，飽和濕度條件下培養，貼壁生長及傳代培養以用于實驗。

1.1.2試劑與設備：提取miRNA的Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉錄及qRT-PCR試劑盒，所用內參U6、miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d的引物均購自廣州復能基因有限公司。U6引物序列：5'-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3'；miR-146a引物序列：5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGUU-3'；miR-146b引物序列：5'-UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCUG-3'；miR-181a引物序列：5'-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3'；miR-181b引物序列：5'-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU-3'；miR-181c引物序列：5'-AACAUUCAACCUGUCGGUGAGU-3'；miR-181d引物序列：5'-AACAUUCAUUGUUGUCGGUGGGU-3'。7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2方法

1.2.1RNA提取：根據Trizol使用說明書提取組織總RNA后，分光光度計檢測RNA的濃度及A260/A280的數值，結果A260/A280>1.8。

1.2.2miR-146和miR-181表達檢測：采用qRT-PCR法檢測細胞中miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d的表達。細胞培養48 h后收樣，棄培養基加入Trizol裂解液1 ml，按Trizol法提取總RNA，測量總RNA濃度。取總RNA 1 μl，2.5 U/μl Poly A Polymerase 1 μl，5×PAP/RT Buffer 5 μl，RTase Mix 1 μl，加ddH2O(RNase/DNase free)至25 μl配制成逆轉錄體系，按照All-in-oneTM miRNA First-Stand cDNA Synthesis Kit試劑盒操作說明進行逆轉錄。反應溫度：37℃，60 min，85℃，5 min，4℃保存備用。按照All-in-oneTM miRNA qPCR Primers試劑盒操作說明檢測miR-181及miR-146家族各成員在細胞中的表達量，以U6作內參，以2-ΔΔCt值計算各組細胞中miR-181及miR-146家族各成員的相對表達量。根據待測標本的Ct值，以U6作為內參照，采用定量PCR中的相對定量法，以n=2-ΔCt表示標本中miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c及miR-181d的相對表達量，其中ΔCt=CtmiR-146/181-CtU6。

2 結果

2.1TPC-1和BCPAP細胞中miR-181和miR-146家族各成員的相對表達量 miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d在TPC-1和BCPAP細胞中的相對表達量見表1。

表1 TPC-1及BCPAP細胞中miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d的表達情況

2.2miR-181和miR-146家族各成員的表達與BRAFV600E基因突變的關系 miR-146a、miR-181a、miR-181b、miR-181c及miR-181d在BRAFV600E基因突變細胞株BCPAP中的表達量較無BRAFV600E基因突變細胞株TPC-1明顯增高(P<0.01)。而miR-146b在BRAFV600E基因突變細胞株BCPAP中的表達量較無BRAFV600E基因突變細胞株TPC-1明顯減低(P<0.01)。見表2和圖1。

圖1 miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c及miR-181d在TPC-1及BCPAP細胞中的表達量比較

表2 TPC-1與BCPAP細胞中miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d表達水平比較

3 討論

近年來，甲狀腺癌的發病率逐年升高，已引起人們的廣泛關注。隨著分子生物學的發展，人們認識到僅根據以往的臨床病理指標已不足以對甲狀腺癌的早期診斷和預后做出準確的判斷，而需要從基因水平尋找進一步判斷的方法。BRAFV600E基因突變及miRNAs的表達失調在甲狀腺癌的發生與轉移過程中發揮著重要作用，已成為腫瘤研究的熱點。

多種miRNA在甲狀腺癌中的表達水平有不同程度的上調或下調，如miR-146、miR-155、miR-181、miR-187、miR-221、miR-222、miR-224、miR-197、miR-30、miR-152等[3-5]。其中miR-146及miR-181上調均可通過調節核因子-κB通路而促進細胞炎癥反應，從而促進正常細胞向腫瘤細胞轉化[6-7]；同時BRAFV600E基因突變同樣可以通過核因子-κB的活化增加金屬蛋白酶組織抑制劑-1及基質金屬蛋白酶-3的表達，從而增加甲狀腺癌的侵襲性[8]。而miRNAs的表達與BRAFV600E基因突變有無相關性尚有爭論。

既往的實驗研究表明，miR-181家族各成員在大部分的腫瘤中起到致癌作用，但在非小細胞肺癌和膠質瘤中發揮抑癌作用[9-11]。其中miR-181a作為上皮間質轉化調節因子的作用在肺腺癌細胞系中被證實[12]。miR-181b以轉化生長因子-β1依賴性方式調節肺腺癌[13]。對于患有腎乳頭狀細胞癌的患者，miR-181c的下調表達與更差的總生存期相關[4]。在膠質瘤及B細胞淋巴瘤中miR-181d的靶基因強調其腫瘤抑制作用[14]。其中miR-181b在某些腫瘤如結腸癌、乳腺癌、肺癌中高表達[15-17]。本實驗結果顯示，miR-181b和miR-181d均在甲狀腺癌中呈高表達，但各自在甲狀腺癌中的作用尚不明確。Qiu等[18]的研究顯示，miR-146a和miR-146b在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達明顯上調。本實驗證實，miR-146a在甲狀腺癌中高表達，但根據以往諸多實驗推測，雖然miR-146b較miR-146a表達低，但miR-146b在甲狀腺癌中可能同樣呈高表達狀態。而關于miR-146對甲狀腺癌生物學行為的影響需還進一步的實驗證實。

BRAF基因V600E的點突變是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑異常的主要原因，而MAPK途徑的異常激活是甲狀腺癌的主要遺傳學改變。該信號通路具有調節細胞生長、增殖和凋亡的重要作用。本研究發現miR-146a及miR-181家族中各成員的表達在BRAFV600E基因突變細胞株BCPAP中較無BRAFV600E基因突變細胞株TPC-1明顯升高，miR-146b的表達明顯減低。該結果表明miR-146及miR-181家族中各成員的表達與BRAFV600E基因突變有極強的關聯。Chou等[19]的研究同樣顯示，在BRAFV600E基因突變的甲狀腺乳頭狀癌患者中miR-146b表達顯著低于對照的BRAFV600E基因未突變組，與本實驗結果一致。

雖然關于甲狀腺癌中miRNA相關研究仍處于初級階段，而且miRNA的表達失調在甲狀腺癌中發揮的作用及機制也有待進一步研究。但是，可以肯定miRNAs在甲狀腺癌的發生、發展過程中具有重要作用，并且miRNAs在外周血中表達較為穩定，不易被內源性RNA酶降解。故本研究為下一步通過體外調控miR-146a、miR-181b、miR-181d的表達對甲狀腺乳頭狀癌細胞系生物學行為的影響奠定了基礎。BRAFV600E基因突變和miR-146及miR-181家族成員有望成為甲狀腺惡性腫瘤篩查、診斷、預后評估新的分子標記物。