枸杞多糖通過下調miR-365抑制皮膚鱗癌A431細胞增殖的機制研究

陳姣蓉，王嘉琪，黃 征

皮膚鱗癌是繼基底細胞癌之后另一常見的非黑色素性皮膚癌，好發于50歲以上的老年人，多見于手背、頭皮和面部等光暴露部位，可發生惡性轉移危及患者的生命安全[1-2]。目前，手術根治性切除仍是皮膚鱗癌治療的重要手段，但隨著人們生活水平的提高，患者對術后要求不斷升高，如何最大限度地改善和保留病灶處的功能與外觀是近年來的研究熱點之一。枸杞多糖(LBP)是常用補益中藥枸杞的主要活性成分之一，已被證實在膀胱癌、肝癌和乳腺癌等多種腫瘤疾病中表現出較好的抗腫瘤作用[3-6]，但LBP與皮膚鱗癌的相關研究鮮有報道。因此，本研究采用不同濃度的LBP處理人皮膚鱗癌A431細胞，觀察其對細胞增殖的影響，并探討可能的分子機制，以期為皮膚鱗癌的治療提供新的方向和線索。

1 材料與方法

1.1細胞、試劑與儀器 人皮膚鱗癌細胞株A431細胞購于中科院上海細胞庫，LBP(純度90%)購于南京景竹生物公司。胎牛血清、DMEM培養基購于美國Gibco公司，胰蛋白酶、MTT試劑購于美國Amresco公司，RIPA裂解液購于上海碧云天公司，LipofectamineTM2000、Trizol試劑、反轉錄試劑盒購于美國Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購于大連TaKaRa公司，miR-365mimics及其陰性對照miR-NC購于上海吉瑪生物公司。miR-365和U6內參檢測試劑盒購于上海諾論生物醫藥公司。Bax抗體、Bcl-2抗體購于美國Cell Signaling公司，辣根過氧化物酶標記二抗和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于江蘇碧云天公司。MCO18AIC型CO2培養箱購于日本SANYO公司，MK3型多功能酶標儀購于上海Thermo公司，Gel Doc 2000凝膠掃描儀購于美國BIO-RAD公司。

1.2細胞培養 采用添加10%胎牛血清和50 μg/ml青鏈霉素的DMEM培養基于CO2培養箱(溫度37℃、濕度飽和、CO2體積分數5%)常規培養A431細胞。實驗所有細胞均為對數生長期細胞。

1.3實驗分組與細胞轉染 ①LBP影響A431細胞增殖實驗：根據LBP藥物濃度不同將A431細胞分為4組，分別為0、250、500和1000 mg/L組。②miR-365作用實驗：將A431細胞分為Con組(未給予LBP處理)、LBP組(給予1000 mg/L的LBP處理48 h)、LBP+miR-NC組(轉染miR-NC 24 h后給予1000 mg/L的LBP處理48 h)和LBP+miR-365組(轉染miR-365mimics 24 h后給予1000 mg/L的LBP處理48 h)。③細胞轉染：將A431細胞以適當密度接種至6孔細胞板上，置于CO2培養箱中常規培養過夜。待細胞匯合度達80%左右時，將miR-365 mimics和miR-NC參照LipofectamineTM2000說明書步驟轉染至A431細胞中。轉染4 h后，更換新鮮培養液繼續培養24 h。

1.4MTT法檢測A431細胞增殖 以胰蛋白酶消化收集待檢測的A431細胞，以每孔4000個細胞接種于96孔板上。每組設5個平行孔。CO2培養箱內培養所需時間后，取出培養板，加入5 g/L的MTT試劑繼續培養4 h后，再加入200 μl二甲基亞砜震蕩反應10 min。多功能酶標儀在570 nm處檢測各組細胞吸光度值。以藥物處理組與空白對照組吸光度值的比值表示細胞活力。實驗重復3次。

1.5RT-PCR檢測A431細胞中miR-365的表達 收集待檢測的A431細胞，加入Trizol試劑提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄合成cDNA。取模板cDNA 2 μl，加入濃度為5 pmol/ml的上下游引物各2 μl、SYBR Green Mix(2×)25 μl和ddH2O 21 μl配成50 μl的反應體系；按照95℃ 300 s，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s(共40個循環)的反應條件，參照miR-365和U6內參檢測試劑盒說明書進行擴增，采用2-ΔΔCt法計算A431細胞中miR-365的表達。

1.6Western blot檢測A431細胞中Bax和Bcl-2蛋白的表達 向待測的A431細胞中加入RIPA裂解液抽提總蛋白。以BCA法對總蛋白定量后，加入2×蛋白上樣緩沖液沸水浴加熱5 min。參照試劑盒說明書配制SDS-PAGE凝膠后，放入電泳槽內，按照每孔50 μg變性蛋白上樣至凝膠孔中，以80 V電壓電泳20 min后換成120 V電壓至電泳結束。以100 mA恒流電轉印至PVDF膜后，取出膜浸入含5%脫脂奶粉的封閉液中搖床孵育2 h。以1∶1000的一抗工作液4℃孵育24 h后，1∶2000的二抗工作液室溫孵育1 h。滴加發光劑顯影、曝光，采用凝膠成像系統掃描分析。

2 結果

2.1LBP對A431細胞增殖的影響 與0 mg/L組比較，250 mg/L組A431細胞增殖無顯著影響(P>0.05)，而500和1000 mg/L組能夠呈時間-劑量依賴性抑制A431細胞增殖(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度和時間LBP對A431細胞增殖的影響

圖2 不同濃度LBP對A431細胞中miR-365表達的影響

2.4miR-365表達對LBP調控A431細胞增殖的影響 與Con組比較，LBP組和LBP+miR-NC組細胞的增殖活力均顯著降低(P<0.05)；與LBP組比較，LBP+miR-NC組細胞增殖活力無顯著變化(P>0.05)，但LBP+miR-365組的細胞增殖活力顯著升高(P<0.05)。見圖4。

圖4 miR-365表達對LBP調控A431細胞增殖的影響

2.5miR-365過表達對LBP調控A431細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達的影響 與Con組比較，LBP組和LBP+miR-NC組細胞中Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，而Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與LBP組比較，LBP+miR-NC組細胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達水平無顯著改變(P>0.05)，但LBP+miR-365組細胞Bcl-2蛋白表達顯著升高，而Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖5。

圖3 轉染后各組A431細胞中miR-365的表達水平

圖5 miR-365過表達對LBP調控A431細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

3 討論

中藥枸杞子是茄科寧夏枸杞的成熟果實，具有滋補肝腎和益精明目的功效[7]，還被證實具有抗氧化、抗衰老、降血糖和抗腫瘤等藥理作用[8-10]；LBP是枸杞子的主要活性成分，因具有來源廣泛，不良反應低和不易產生耐藥等優勢，逐漸引起腫瘤研究學者們的關注。在MMTV-PyMT乳腺癌小鼠體內實驗中，LBP可通過抑制腫瘤細胞增殖和血管生成等作用抑制乳腺癌的生長和轉移[11]。體外細胞培養實驗中，LBP可通過下調基質金屬蛋白酶-2/9和抑制上皮間充質轉化從而抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移[12]；LBP還可通過誘導細胞凋亡和自噬抑制人舌鱗癌CAL-27細胞增殖[13]。本研究以不同濃度(0、250、500和1000 mg/L)LBP處理皮膚鱗癌A431細胞不同時間后發現，500、1000 mg/L的LBP能夠呈時間-劑量依賴性抑制A431細胞增殖。結果表明，LBP可通過抑制癌細胞增殖發揮抗皮膚鱗癌的作用。

除上述作用外，LBP還可通過激活Nrf2對紫外線照射引起的人皮膚成纖維細胞和人角質形成細胞損傷等具有較好的保護作用[14-15]。微小RNA是一類長約22個核苷酸的RNA分子，與多種人類疾病的發生相關[16-17]。既往研究證實，過度的紫外線照射是導致皮膚鱗癌發生的重要原因[18-20]，而紫外線照射可引起miR-365表達升高，高表達的miR-365可通過靶向核因子I/B在皮膚鱗癌的發生發展過程中發揮著重要的促進作用[21-22]；另外以抗miR-365寡核苷酸作用后可通過誘導細胞周期阻滯G1和細胞凋亡抑制皮膚腫瘤的形成[23]。為了探討LBP抗皮膚鱗癌的分子機制，本研究進一步檢測miR-365的表達。結果發現，500、1000 mg/L的LBP能夠呈劑量依賴性抑制miR-365的表達。這提示miR-365可能參與了LBP調控皮膚癌細胞增殖的過程。為了進一步探討miR-365在皮膚癌細胞增殖中的作用，本研究將miR-365mimics轉染至A431細胞中，給予1000 mg/L的LBP處理，結果檢測到成功上調miR-365表達可有效逆轉LBP對A431細胞增殖的抑制作用；同時，還可有效逆轉LBP引起的抑凋亡蛋白Bcl-2表達降低和促凋亡蛋白Bax表達升高[24-26]。上述結果表明，miR-365通過調控Bcl-2和Bax蛋白的表達抑制LBP誘導的細胞凋亡。提示miR-365參與了LBP抑制皮膚鱗癌細胞增殖的分子過程。

綜上所述，LBP可抑制皮膚鱗癌A431細胞增殖，其作用機制可能與LBP抑制miR-365的表達有關。