利用CRISPR/Cas9 AAV系統構建紋狀體Slc20a2基因敲除小鼠模型

林珉婷，賴璐璐，趙淼，林必瑋，姚香平,3

利用CRISPR/Cas9 AAV系統構建紋狀體基因敲除小鼠模型

林珉婷1,2，賴璐璐1，趙淼1，林必瑋1，姚香平1,3

1. 福建醫科大學附屬第一醫院神經內科，福州 300005 2. 福建醫科大學神經科學研究院，福州 300004 3. 福建省分子神經病學重點實驗室，福州 300005

原發性家族性腦鈣化癥(primary familial brain calcification, PFBC)是慢性進展性的神經系統遺傳病，臨床癥狀主要包括運動障礙、認知障礙及精神障礙等，其致病機制尚未完全明確。研究表明是該病最主要的致病基因。由于基因全身性敲除小鼠模型會導致胎兒生長受限，為更好地研究PFBC發病機制，本研究應用CRISPR/Cas9技術構建了紋狀體基因條件性敲除小鼠模型。首先，針對基因編碼區，設計3條靶向exon3的sgRNA (single guide RNA)，通過構建質粒、轉染細胞、Surveyor assay等實驗驗證sgRNA的活性。其次，選取活性較高的sgRNA重組包裝AAV-Cre病毒，應用立體定位將AAV病毒定點注射于小鼠紋狀體。體外實驗結果表明設計的3條sgRNA均能夠有效地介導Cas9切割靶DNA。細胞免疫熒光實驗結果證實AAV-Cre病毒具有Cre重組酶活性。最后，通過小鼠腦部組織免疫組化、TA-克隆、高通量測序及Western blot方法檢測基因敲除效率，發現實驗組小鼠紋狀體組織表達明顯降低。本研究成功設計了3條能夠敲除的功能sgRNA，并應用CRISPR/Cas9技術成功構建了紋狀體基因條件性敲除小鼠，為研究PFBC的發病機制提供了有效的動物模型。

CRISPR/Cas9；；sgRNA；基因敲除；小鼠模型

原發性家族性腦鈣化癥(primary familial brain calcification, PFBC)是以紋狀體、丘腦、小腦、皮層等部位對稱性鈣化為特征的神經系統遺傳病[1]。臨床主要表現為運動障礙、精神癥狀、認知障礙、癲癇、頭痛等癥狀。……