保護性耕作對西北旱區(qū)叢枝菌根真菌及土壤理化性質的影響

楊 華，李 彤，王威雁，溫曉霞，李亞君，廖允成

(西北農林科技大學 農學院，陜西楊凌 712100)

土壤耕作對農業(yè)生產有著極其關鍵的影響，對土壤結構、土壤肥力以及土壤生態(tài)產生比較顯著的影響[1]。保護性耕作與常規(guī)耕作方式相比，一方面能夠降低勞動力的需求，減少成本投入，另一方面能夠使土壤具有穩(wěn)定的土層結構，優(yōu)化土壤的理化性質，有效抑制土壤的水分以及營養(yǎng)流失，促進土壤有益微生物的繁殖生長。而常規(guī)耕作處理會對土壤的理化性質產生干擾，破壞土壤中微生物的群落結構[2]。研究表明，叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizae ,AM)真菌可以與大部分陸地植物的根系構成共生系統(tǒng)[3]。就農作物而言，AM真菌可以促進其根系吸收水分和礦物質營養(yǎng)[4]，增強農作物在生物脅迫下的生存能力[5]以及對惡劣環(huán)境的抵抗力[6]，能夠在一定水平提高植物多樣性[7]。研究表明，AM真菌易受農作措施的影響，比如耕作措施、施肥條件[8-10]。保護性耕作下土壤的土層結構相對穩(wěn)定，AM真菌生物量較高，侵染效果明顯[11]，AM真菌群落豐度提高[12]，物種多樣性增加[11,13]。土壤pH、有機碳含量、速效磷含量等是影響AM真菌群落結構差異的重要因素[14]。此外，Davison等[15]通過深入研究NS31-AM1引物區(qū)段，系統(tǒng)地研究了每一個公開的AM真菌序列，在序列相似性97%的精度下劃分出356個AM真菌分子種，以Schüler建立的分類系統(tǒng)為依據，創(chuàng)建了Maarj AM數據庫(https://maarjambo-tany.ut.ee/)，將孢子種相應區(qū)段的DNA序列作為參考，將劃分出的分子種歸類至屬甚至種的水平，稱之為虛擬種(Virtual taxa，VT)。目前，高通量測序越來越多地應用到AM真菌研究中[16-17]。

目前，研究主要集中在AM真菌提高作物的養(yǎng)分(尤其是磷肥)吸收、抗逆性等方面，而本試驗從保護性耕作對AM真菌影響的角度出發(fā)，研究土壤耕作方式對AM真菌的影響以及主要因素。研究長期保護性耕作下農田土壤中AM真菌的生物量、侵染效果及群落結構的差異，對選擇合理的耕作方式、充分利用AM真菌資源提供理論依據。試驗組采用免耕和深松耕，對照組采用翻耕，結合大田觀測和ILLumina Miseq高通量測序技術，探討長期連續(xù)免耕、深松耕和翻耕對土壤中AM真菌生物量、侵染效果和群落結構的影響及其與土壤理化性質的響應關系。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地在陜西省楊凌區(qū)西北農林科技大學北校區(qū)西區(qū)，該地區(qū)位于渭北旱塬，主要氣候為暖溫帶季風性氣候，海拔高度446 m，年日照時長大約為2 150 h，年平均氣溫為12 ℃～14 ℃，每年約有221 d的無霜期，降雨量與蒸發(fā)量分別為621.6和993 mm，試驗選用的土壤為塿土。

從2009年開始，試驗田采用一年兩熟的復種模式，分別種植冬小麥和夏玉米，設置兩種保護性耕作：秸稈還田免耕(簡稱免耕，ZT)和秸稈還田深松耕(簡稱深松耕，CPT)。同時設置一種常規(guī)耕作方式：秸稈還田翻耕(簡稱翻耕，PT)。每種耕作處理設置3個重復，共劃分9個小區(qū)，每個小區(qū)的面積為375 m2(15 m×25 m)。在玉米播種前，所有處理均施用尿素[w(N)>46%]和磷酸鈣[w(P)>16%]750 kg·hm-2。

1.2 樣品采集

土壤樣品及玉米根系樣品采集時間為2018-08-15，此時玉米正處于吐絲期。采用五點取樣法，在無根區(qū)域使用土鉆采取2～30 cm的土壤，混合均勻后過1 mm篩，并將過篩后的土壤放入無菌自封袋中，作為該耕作處理的一個樣本。所有土壤樣品在低溫冰盒內帶回實驗室，一部分保存于-80 ℃冰箱，用于土壤微生物總DNA提取；一部分放在自然通風的環(huán)境下風干，用于土壤理化性質、孢子數、菌絲密度的測定。從2～30 cm土層取玉米新生根樣10 g左右，用清水清洗，放置在FAA固定液中，用于測定侵染率。每個處理3個重復，土壤和根系各采集9個樣品。

1.3 土壤理化指標的測定

土壤理化性質的測定方法如下：利用激光粒度儀測定土壤粉粒、黏粒及砂粒所占比重；利用電位法進行土壤酸堿度的測量(水土體積比例為 5∶1)；利用凱氏定氮法測定土壤全氮含量[2,18]；土壤中硝以及銨態(tài)氮含量利用2 mol·L-1KCL浸提，使用全自動間斷分析儀測定[19]；利用重鉻酸鉀外加熱法測定土壤中有機碳含量；利用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定土壤速效磷含量[20]。

1.4 AM真菌生物量和侵染效果的測定

取新鮮玉米根系，剪成長度為1 cm的根段放入根盒中，利用醋酸墨水進行根段的染色[23]，染色過程結束后，使用清水進行根段的清洗，在顯微鏡下觀察。根據菌根侵染和叢枝豐度分級標準將等級參數輸入到MYCOCALC軟件中,利用該軟件進行菌根侵染頻率，整個根系的菌根侵染強度和根系叢枝豐度的計算[22]。

1.5 土壤總DNA提取與PCR擴增

按照E.Z.N.A.soil試劑盒操作規(guī)范抽提土壤DNA，使用NanoDrop2000測定DNA質量濃度與純度。所有樣品的AM真菌DNA采用巢式PCR擴增。第一對引物：AML1F(5′-ATCA ACTTTCGATGGTAGGATAGA-3′)和AML 2R(5′-GAACCCAAACACTTTGGTTTCC-3′)，第二對引物：AMV4-5NF(5′-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3′)和AMDGR(5′-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3′)[24]。PCR擴增程序如下：98 ℃5 min；98 ℃45 s，58 ℃50 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min[25]。

1.6 Illumina Miseq測序

使用20 g·L-1瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)純化，Tris-HCl洗脫，瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用QuantiFluorTM-ST進行定量檢測。根據Illumina MiSeq平臺(Illumina,SanDiego,USA)標準操作規(guī)程純化擴增片段，構建PE 2*300文庫。測序在Miseq PE300平臺進行(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.7 數據處理與分析

使用Excel 2007和SPSS 21進行數據整理、統(tǒng)計分析，使用Excel 2007進行繪圖。利用Person相關系數評價土壤理化性質與侵染效果以及AM真菌生物量之間所存在的內在關聯(lián)。高通量測序原始序列通過Trimmomatic軟件質控，使用FLASH軟件拼接。使用UPARSE 軟件(version 7.1)對所有序列進行OTU聚類(97%相似度)，并將嵌合體及單序列去除。所得序列利用RDP classifier進行物種分類注釋，與Silva數據庫(SSU123)比對，比對閾值為70%。按照最小樣本序列數對測序所得數據抽平處理后，進行AM真菌群落結構分析，包括Alpha多樣性、物種組成分析、基于Bray-Curtis算法的Beta多樣性分析以及利用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行物種差異分析。同時采用冗余分析(RDA分析)進行土壤理化性質與AM真菌群落結構的相關性分析。數據以“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 不同耕作處理對土壤理化性質的影響

由表 1 可知，不同耕作方式改變土壤的理化性質。翻耕的土壤中黏粒含量顯著高于深松耕(6.70%)。深松耕和免耕的土壤中粉粒含量顯著高于翻耕(2.34%和1.75%)，深松耕和免耕的土壤中粉粒含量無顯著差異。深松耕的土壤中砂粒含量顯著高于免耕(56.98%)和翻耕(73.46%)，免耕與翻耕的土壤中砂粒含量無顯著差異。翻耕的土壤pH顯著高于深松耕(1.91%)和免耕(2.30%)，深松耕和免耕的土壤pH無顯著差異。深松耕與土壤中有機碳含量高于免耕(8.57%)，免耕高于翻耕(28.36%)，三者差異顯著。深松耕的土壤中全氮含量高于免耕(14.97%)，免耕高于翻耕(15.75%)，三者差異顯著。三種耕作處理土壤中的硝、銨態(tài)氮含量無顯著差異。翻耕的土壤中速效磷含量高于深松耕(15.79%)，深松耕高于免耕(19.16%)，三者差異顯著。

表1 不同耕作處理下土壤的理化性質

2.2 不同耕作處理對AM真菌生物量的影響

如圖1-A所示，20 g 土壤中，免耕處理的孢子數顯著高于深松耕(24.82%)，深松耕土壤中孢子數顯著高于翻耕(82.89%)。由圖1-B可知，免耕和深松耕土壤中菌絲密度顯著高于翻耕，分別高57.04%和43.17%，免耕與深松耕無顯著性差異。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)；下同

2.3 不同耕作處理對AM真菌侵染效果的影響

如圖2所示，免耕和深松耕條件下AM真菌對玉米根系的侵染率顯著高于深松耕(2.17%和35.57%)；免耕條件下AM真菌對玉米根系的侵染密度顯著高于深松耕(17.19%)，深松耕下侵染密度顯著高于翻耕(42.33%)；免耕條件下AM真菌在玉米根系中的叢枝豐度顯著高于深松耕(28.36%)，深松耕下AM真菌在玉米根系中的叢枝豐度顯著高于翻耕(50.09%)。

圖2 不同耕作處理下AM真菌對玉米根系侵染效果的差異

2.4 土壤理化性質與AM真菌生物量、侵染效果的相關性

如表2所示，土壤樣品的粉粒含量和與侵染密度以及侵染率之間呈正相關，且具有顯著性(P<0.05)；土壤樣品的pH與侵染效果以及AM真菌生物量之間呈負相關系，且具有顯著性(P<0.01)；土壤樣品的有機碳含量與AM真菌的各項指標之間均呈正相關關系，且具有顯著性(P<0.05)；土壤樣品的全氮含量與侵染率及菌絲密度呈正相關，且具有顯著性(P<0.05)；土壤樣品的速效磷含量與AM真菌的所有指標都存在著負相關關系，且具有顯著性(P<0.01)。

《莊子·天道》：……水靜猶明，而況精神！……夫虛靜恬淡，寂寞無為者，天地之本，而道德之至，故帝王圣人休焉。休則虛，虛則實，實則備矣。虛則靜，靜則動，動則得矣。

表2 AM真菌生物量、侵染效果與土壤性質的相關性

2.5 不同耕作處理對AM真菌群落結構的影響

通過高通量測序產生高質量序列共計 495 424條，平均每個測序樣本含有序列55 047條，所有序列可以劃分為60個OTUs，其中有效序列488 671條，占總序列數的98.67%。分析溶解曲線可知，在相似度為97 %的情況下，各個樣品所對應的覆蓋率指數(Coverage value)都超過99 %水平，說明當前測序工作的深度滿足評價該土壤AM真菌群落結構多樣性的要求。

根據Maarj AM數據庫(https://maarjambo-tany.ut.ee/)中對AM真菌虛擬種的歸類，本試驗共鑒定發(fā)現AM真菌包含4個屬的25個虛擬種(表3)。不同耕作處理下，土壤AM真菌屬和虛擬種數量不同。其中在深松耕處理下，土壤中鑒定到3個屬的17個虛擬種；免耕處理下，土壤中鑒定到4個屬的19個虛擬種；翻耕處理下，土壤中鑒定到2個屬的12個虛擬種。

表3 不同耕作處理下AM真菌的屬和虛擬種

對不同耕作處理下土壤AM真菌的Alpha多樣性指數進行方差分析，結果如表4所示，在OTU水平上，深松耕土壤中AM真菌的Sobs值顯著高于翻耕，說明深松耕土壤中實際觀測到的OUT數目高于翻耕土壤。深松耕和免耕處理下，土壤中AM真菌的Shannon值顯著高于翻耕土壤，說明深松耕、免耕土壤中AM真菌的多樣性高于翻耕土壤。深松耕土壤中AM真菌的豐富度指數(Chao1)顯著高于翻耕，說明長期深松耕處理下AM真菌的豐富度高于翻耕土壤。

表4 不同耕作處理下AM真菌AlpHa多樣性(OTU水平)

2.6 AM真菌群落結構與土壤理化性質的相關性

如圖3所示，同一耕作處理的3個樣本的群落結構相似，且與其他耕作處理不同。ANOSIM分析表明，不同耕作處理間AM真菌群落的組間差異大于組內差異(R=0.37)，且不同耕作處理AM真菌群落結構的差異達到顯著水平(P<0.05)。冗余分析結果顯示，本試驗測定的土壤理化性質共解釋81.33%AM真菌群落結構的差異。其中，第一排序軸解釋群落結構差異的 46.0%，第二排序軸解釋16.1%。蒙特卡洛檢驗(Monte Carlo檢驗)結果顯示，有機碳(F=4.3，P=0.002，解釋量為38.2%)、速效磷(F=2.4，P=0.006，解釋量為17.7%)對AM真菌群落結構有顯著影響。

SOC.有機碳；TN.全氮；AN.銨態(tài)氮；NN.硝態(tài)氮；AP.速 效磷

3 討 論

3.1 保護性耕作對土壤理化性質的影響

不同的耕作處理對土壤的理化性質產生影響。保護性耕作減少了對土壤的擾動，有助于形成穩(wěn)定的土層結構。深松耕和免耕的土壤中粉粒含量提高，黏粒含量降低，pH降低。此外，保護性耕作減少了有機質的礦化作用，有助于促進有機質積累[1]，與前人的研究結果一致。不同耕作措施對速效磷含量的影響一致存在爭議，本試驗結果與張貴云等[26]、田慎重等[27]研究結果不同，但與賈鳳梅等[28]、李永平等[29]研究結果一致。

3.2 保護性耕作對土壤真菌生物量、侵染及群落結構的影響

農田耕作措施對土壤的擾動對大多數AM真菌來說可能是不利的[30]，本研究表明，長期免耕、深松耕處理下，土壤中孢子數量、菌絲密度、侵染率、侵染密度以及根系叢枝豐富度皆高于翻耕。土壤耕作處理可以破壞菌絲網絡，直接影響AM真菌的生長、繁殖，降低其侵染能力[31-32]。

本試驗只檢測到4個屬，即球囊霉屬(Glomus)、無梗囊霉屬(Acaulospora)、多孢囊霉屬(Diversispora)以及巨孢囊霉屬(Gigaspora)。其中，球囊霉屬(Glomus)在土壤中豐度極高，這與前人研究結論一致[19]，而其他屬豐度很低。球囊霉屬(Glomus)的優(yōu)勢說明該屬在農田條件下具有較高的生存能力。主要原因在于，相比較于其他AM真菌種類，球囊霉屬(Glomus)不僅可以通過孢子繁殖，還可以通過殘留的菌絲片段進行繁殖[33]，而巨孢囊霉屬(Gigaspora)只能通過孢子散布或通過完整的菌絲來侵染繁殖[34]。此外，Giovannetti等[35]的研究已經表明，Glomus屬很容易在菌絲之間形成連接，因此在農田土壤受到機械破壞后可以較快地重建菌絲網絡，恢復自身的生長與繁殖。這也解釋了本試驗中土壤耕作(免耕、深松耕、翻耕)對Glomus屬的優(yōu)勢地位未產生影響，但是，免耕土壤中保存了更多AM真菌的種類，而劇烈的土壤擾動使翻耕土壤中有些AM真菌種類在本次測序結果中檢測不到。

盡管在屬水平3種耕作處理土壤中AM真菌的群落結構豐度無明顯差異，但是在分子種及OTU水平仍可以發(fā)現不同耕作處理對AM真菌群落結構的多樣性產生一定影響，對于保護存在于土壤里的AM真菌而言，深松耕及免耕的方式作用明顯。

3.3 不同耕作處理下，AM真菌生物量、侵染及群落結構與土壤理化因子的關系

土壤pH與AM真菌生物量及侵染效果均呈顯著負相關。以往的研究結果顯示，AM真菌產孢在一定程度受到土壤pH的影響，進而對AM真菌多樣性產生作用[36-37]。在pH 7.8～10.5隨著pH升高，AM真菌孢子數降低，不同種類對其抗性有所差異[38]。

有機碳含量與AM真菌生物量及侵染效果呈顯著正相關。冗余分析結果表明，土壤中AM真菌的群落結構也受到有機碳的顯著影響。有機質可以為AM真菌提供生長環(huán)境，提高其侵染能力，有機碳含量增加可以促進AM真菌分枝，AM真菌菌絲傾向在土壤有機碳中或者有機碳周圍聚集并增殖[39]。此外，如果在土壤中存在比較高的有機質含量，則會促進菌根的發(fā)育以及菌絲的生長，然而這種促進作用是有一定限制的[40]，在一定區(qū)間內，土壤中有機質含量越豐富,AM真菌的種類就越多,但超過閾值后,AM真菌的分布就隨著有機質含量的增加而減少[41]。

速效磷含量與AM真菌生物量及侵染效果呈顯著負相關，冗余分析結果表明，土壤中AM真菌群落結構受到速效磷含量的顯著影響，與前人研究結果一致[42]。在營養(yǎng)充足的土地中增施P肥則減少孢子數量、菌絲分枝和菌絲總長度[43-44]。如果土壤里的磷含量比較高，植物和AM真菌的共生關系將會出現利益分配的改變，植物對AM真菌提供的物質與能量減少[22]，將會在一定程度上抑制其泡囊發(fā)育[43]。在長時間的植物選擇之后，部分物種因無法獲得充足能量供給而逐漸被自然界淘汰，所以在翻耕處理的土壤里，速效磷相對比較高的含量將會導致AM真菌多樣性的降低。

總之，常規(guī)耕作方式下，定期翻耕引起土壤理化性質改變，提高土壤pH，使土壤中有機碳的含量降低，而速效磷的含量增加，改變土壤中AM真菌群落結構組成，降低AM真菌在作物生長過程中的貢獻。相反，保護性耕作如免耕、深松耕為AM真菌的生長提供穩(wěn)定的生存環(huán)境，在一定程度上保護AM真菌的多樣性。

本研究雖以10 a長期定位試驗為基礎，但取樣只有1 a的吐絲期，沒有覆蓋全部生育期。在以后的研究中將增加關鍵生育期并增設取樣年份，以便獲得更全面的研究結論和動態(tài)結果。