白菜型冬油菜 ELIP1基因的克隆與低溫表達分析

何輝立，方 彥,馬 驪，孫柏林，劉麗君，武軍艷，董 云,4，孫萬倉，金嬌嬌，李學才

(1.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室, 蘭州 730070; 2.甘肅省油菜工程技術研究中心, 蘭州 730070; 3.河北中旭檢驗檢測技術有限公司, 石家莊 050200；4.甘肅省農業科學院作物研究所,蘭州 730070)

植物早期光誘導蛋白(early light-induced protein, ELIPs)是核基因編碼的葉綠體類囊體膜蛋白[1]，屬于葉綠素結合蛋白超家族(chlorophyll a/b binding superfamily, CABs)。其最早發現于黃化豌豆幼苗去黃化試驗中[2]，具有光保護作用[3]。ELIP蛋白也是一種逆境脅迫響應蛋白，植物在受到高鹽[4]、干旱和低溫等多種非生物脅迫時體內ELIP被誘導且表達量提高[5]。低溫脅迫是ELIP基因表達的主要誘導因素之一[3]。低溫馴化過程中，豌豆(PisumsativumLinn)[6]、大麥(Hordeumvulgare)[7]、擬南芥[8](Arabidopsisthaliana)和鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)[9]等多種物種ELIP基因被誘導表達，對提高植物抗寒性十分重要。Shimosaka等[10]研究發現，小麥中ELIP在低溫脅迫過程中被大量誘導產生，具有增強植物抵御抗寒的能力。在冷馴化中誘導表達ELIP基因有助于紫花苜蓿falcata抗寒性的提高[11]。

白菜型冬油菜是北方旱寒區一種重要的越冬經濟作物，可在北方不同生態區正常越冬[12]，蘊藏著豐富的抗寒基因，是研究植物抗寒性及獲得抗寒基因的重要材料。甘肅省干旱生境作物學重點實驗室前期在用轉錄組學分析方法篩選白菜型冬油菜的冷誘導差異基因時，從數據庫篩選和鑒定出參與低溫誘導途徑的ELIP1基因，為進一步研究ELIP1基因在白菜型冬油菜低溫脅迫中的功能，本試驗克隆8個不同抗寒性冬油菜品種葉片中的ELIP1基因，運用生物信息學方法預測該基因的結構和功能，并利用實時熒光定量PCR技術研究不同抗寒性冬油菜品種在低溫脅迫下的表達模式，研究結果有助于理解ELIP1基因在冬油菜抗寒性中的作用，并對后期開展的抗寒育種有一定參考意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取8份白菜型冬油菜為試驗材料，來源及特性見表1。

表1 品種名稱與來源

1.2 試驗設計

采用盆栽試驗，將籽粒飽滿的各品種油菜種子播種至裝有育苗基質的營養缽中(9 cm×7.5 cm)，每缽4株，放置于甘肅農業大學校園溫室大棚中，培養至五葉期。選取健壯、長勢一致的不同油菜幼苗在25 ℃(CK，光照14 h，黑暗10 h)和 4 ℃(光照14 h，黑暗10 h)各處理2 d，取第5片真葉用錫箔紙包裹，液氮速凍后放于-70 ℃超低溫冰箱保存，備用。

1.3 方 法

1.3.1 RNA提取及反轉錄 參照天根試劑盒DP419說明書提取各樣品總RNA，電泳檢測后，按TaKaRa cDNA第一鏈合成試劑盒(RR036A)說明書進行反轉錄，得到單鏈cDNA，超微量紫外分光光度計檢測其濃度后置于-20 ℃冰箱保存，備用。

1.3.2 引物設計與ELIP1基因克隆 以實驗室前期轉錄組測序結果為依據，利用Primer Premier 5.0 軟件設計cDNA擴增引物，ELIP1-F：5′-ATGGCAATGGCGTCGTTTAACATG-3′；ELIP1-R：5′-TCAAACGAGAGTCCCACCCTTGA-3′，以4 ℃低溫處理后各品種葉片提取RNA反轉錄的cDNA為模板進行PCR擴增，擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，35個循環；72 ℃10 min；4 ℃保存。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物片段大小，普通瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒(離心柱型)回收目的條帶，將其連接到pMD-19T載體上，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，在含有Amp、X-gal和IPTG的LB固體培養基上，過夜培養12 h后進行藍白斑篩選，挑取白斑至含有Amp的LB液體培養基中搖菌。菌落PCR驗證的陽性克隆，隨機挑選3個送至上海生工生物工程股份有限公司進行克隆結果測序。

1.3.3 ELIP1預測蛋白的生物信息學分析 蛋白質基本理化性質分析采用Protparam；采用Protscale分析氨基酸疏水性?？缒そY構預測采用TMpred Server軟件。利用SignalP-5.0 Server預測蛋白信號肽。利用SOPMA工具預測蛋白質二級結構[13]。NCBI CD-search預測ELIP1蛋白保守結構域。用DNAMAN軟件比較8個白菜型冬油菜品種中ELIP1基因核苷酸序列的同源性。

1.4 白菜型冬油菜 ELIP1基因的熒光定量表達分析

根據獲得的ELIP1基因的CDS序列，設計定量表達引物，ELIP1-F：5′-GAGATGTATGGCTGAG GGAGAA-3′和ELIP1-R：5′-GAGGTGGCGACGATGACTT-3′；內參基因β-actin引物，F：5′-TGTGCCAATCTACGAGGGTTT-3′；R：5′-TTTCCCGCTCTGCTGTTGT-3′，以濃度一致的8個冬油菜品種常溫及低溫處理后葉片cDNA為模板，進行實時熒光定量分析，PCR擴增條件同上。采用2-ΔΔCt方法進行基因差異表達分析。低溫差異表達分析以常溫對照(CK)的表達量為基準。3次重復。

2 結果與分析

2.1 ELIP1基因克隆

通過‘隴油7號’的轉錄組數據分析，發現一條ELIP1基因序列，該基因具有完整編碼區的轉錄本，長度為550 bp。本研究以低溫下8個白菜型冬油菜葉片cDNA和特異性引物為模板，用RT-PCR方法擴增，得到一條550 bp左右(圖1)的擴增產物，與數據庫中ELIP1基因長度吻合。純化回收目的條帶，連接T載體并轉化后進行菌液PCR驗證挑選陽性克隆(圖2)，得到的目的片段大小在550 bp左右，說明克隆的ELIP1已插入載體中。將陽性克隆送上海生工生物工程股份有限公司測序，得到長度為588 bp的編碼區 序列。

圖1 白菜型油菜 ELIP1基因的RT-PCR擴增結果

圖2 白菜型油菜 ELIP1基因菌液PCR鑒定結果

2.2 白菜型冬油菜 ELIP1基因編碼蛋白質的特性分析

對‘隴油7號’ELIP1基因的堿基序列進行開放閱讀框分析，結果顯示ELIP1基因CDS區含有一個長度為588 bp 的完整開放閱讀框(ORF)，編碼含195個氨基酸的蛋白質(圖3)。蛋白質理化性質分析表明，白菜型冬油菜‘隴油7號’ELIP1蛋白由20種氨基酸組成，其中Ala占11.3%，Leu占10.3%；含有13個酸性氨基酸(D、E)，18個堿性氨基酸(K、R)，76個疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)，47個極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)及36個帶電荷的氨基酸(R、K、H、Y、C、D、E)；預測等電點為9.24；相對分子質量為 20.472 8 ku；預測不穩定指數為39.35，是一個穩定蛋白(穩定系數<40時穩定)；總平均親水指數為 0.169，為疏水性蛋白(圖4)。

圖4 ELIP1蛋白的疏水性預測分析

蛋白信號肽預測分析表明白菜型冬油菜ELIP1蛋白信號肽序列沒有斷裂(圖5)?！]油7號’ELIP1蛋白的二級結構(圖6)由α-螺旋(alpha hELIP1x，43.08%)，延伸鏈(extended strand，11.79%)，β-轉角(beta turn，5.13%)和無規則卷曲(random coil，40%)組成。

圖5 預測白菜型冬油菜ELIP1蛋白信號肽

藍色.α螺旋；紫色.無規則卷曲；紅色.延伸鏈；綠色.β轉角。橫坐標數值表示氨基酸序列位置

利用NCBI CD-search預測ELIP1蛋白保守結構域(圖7)，預測結果表明ELIP1含有葉綠素A-B結合蛋白家族特有的保守結構域，該保守結構區域是由93(96～188)個氨基酸組成，說明ELIP1是一種參與光合作用的功能蛋白。

圖7 白菜型冬油菜ELIP1蛋白的保守結構域分析

2.3 各品種白菜型冬油菜 ELIP1基因核苷酸序列對比

利用DNAMAN軟件對不同白菜型冬油菜品種ELIP1基因進行比較(圖8)，8個品種ELIP1基因同源性為99.06%。與參考序列白菜型油菜(XM_009137582)對比，ELIP1基因在8個冬油菜品種中共有21處(圖8)堿基發生突變，其中弱抗寒品種‘Lenox’和‘Neib’各發生一處突變，強抗寒品種‘隴油8號’堿基突變最多，出現18處，其他5個品種發生15～17處變異，說明不同白菜型冬油菜品種在進化中ELIP1基因序列存在單核苷酸多態性。

圖8 8個白菜型油菜品種 ELIP1序列對比結果

2.4 各白菜型冬油菜品種ELIP1蛋白系統進化樹構建與分析

利用MEGA 7.0中鄰近法原則對8個白菜型冬油菜ELIP1構建了進化樹(圖9)，結果顯示國外品種‘Lenox’和‘Neib’聚為一類；其他6個國內品種聚為一大類，表明國外和國內品種其親緣關系較遠。

圖9 ELIP1蛋白序列系統進化樹分析

2.5 低溫脅迫對不同冬油菜品種ELIP1表達的影響

通過比較不同冬油菜品種在常溫和低溫處理后ELIP1 表達水平(圖10)，發現4℃時，超強抗寒品種‘隴油6號’和‘隴油7號’的ELIP1基因表達量高于25 ℃，分別上調了47.99%和 40.46%，其他品種低溫下的表達量均低于常溫，且抗寒性越弱，低溫下表達量越低。其中抗寒品種‘隴油8號’和‘隴油9號’較25 ℃分別下調了8.88%和5.40%，耐寒品種‘天油2號’和‘天油4號’較25 ℃分別下調了49.14%和40.96%，弱抗寒品種‘Lenox’和‘Neib’在4 ℃時ELIP1基因下調了99.51%和98.28%，表達量很少。

不同小寫字母表示不同品種 ELIP1表達量在不同溫度處理間差異顯著(P<0.05)。

3 結論與討論

本試驗從白菜型冬油菜葉片克隆獲得1條含有完整ORF的ELIP1基因，其氨基酸序列與轉錄組數據庫中ELIP1基因序列吻合率為 99.06%，生物信息學分析表明，該基因編碼195個氨基酸，等電點為9.24；相對分子質量為 20.472 8 ku；編碼主要由a-螺旋和無規則卷曲組成的疏水性穩定蛋白。8個油菜品種核苷酸序列對比分析發現，ELIP1基因存在21處突變，其中弱抗寒品種發生突變位置少于抗寒品種；對8個白菜型冬油菜ELIP1構建進化樹進行分析，結果顯示兩個國外引進弱抗寒品種‘Lenox’和‘Neib’聚為一類，‘天油2號’‘天油4號’‘隴油6號’‘隴油7號’‘隴油8號’和‘隴油9號’聚為一大類，表明國外和國內品種其親緣關系較遠。這可能是弱抗寒品種與抗寒品種存在抗寒性差異的主要影響因素。

目前，已在許多物種中克隆出了ELIP基因[14-15]，該基因在受到逆境脅迫時表達量升高，對抵御不同逆境起著重要作用[3]。Montané等[7]研究發現，當溫度在5～25 ℃時，隨著溫度的下降和脅迫時間延長，ELIP基因被誘導程度越高，表達顯著上升。Wei等[16]、Peng等[14]、何飛等[17]、Wang等[18]研究發現，低溫馴化過程中，植物ELIP基因表達量上調，對提高植物抗寒性十分重要。本研究對8個不同冬油菜品種葉片中ELIP1基因的表達分析顯示，4 ℃時，抗寒性越強的品種ELIP1基因表達量越高，表明ELIP1基因可能在冬油菜響應低溫脅迫提高自身抗寒性中發揮重要作用。