林麝腸源和圈舍土源大腸埃希菌的分離鑒定及其耐藥基因的檢測

李怡瑾，邱 宇，田思璐，周劍婧，曹宇恒，趙 位，喻 東，楊 威，羅 燕，程建國

(1.四川農業大學 動物醫學院，成都 611130；2.四川養麝研究所，四川都江堰 611800)

自1929年青霉素問世，抗生素作為人類對抗感染性疾病的武器而被廣泛使用[1]?？股剡@一偉大的發現和應用，使大多數細菌感染性疾病能夠被治愈[2]。但隨著人們對抗生素的過度依賴，出現了廣泛應用甚至濫用抗生素的情況，使得細菌對抗生素的耐藥性日益嚴重[3-4]。林麝(Moschusberezovskii)是名貴中藥材麝香的原動物之一[5]。麝香是傳統四大名貴藥材之一，因其特殊藥理和作用及顯著療效被列入國家專控商品[6]。在飼養條件下，化膿感染和腸道疾病是困擾林麝養殖的主要疾病[7]，大腸埃希菌病雖不及其他傳染病那樣來勢兇猛。但幼麝感染后死亡率高，在臨床上很難治愈[8]。

據報道可知，可移動并傳遞的遺傳載體(如質粒或接合轉座子)是大多數耐藥基因的存在形式，這些基因可經轉化轉移表達并穩定傳代[9]，并在不同菌株甚至不同種屬細菌間相互傳遞[10-11]，形成耐藥基因的可傳播性。在林麝大腸埃希菌耐藥性的研究中，大多研究肺源大腸埃希菌耐藥表型及其耐藥基因型[12-13]，對腸源大腸埃希菌研究較少，關于腸源大腸埃希菌與環境中大腸埃希菌耐藥性及耐藥基因比較鮮有報道。本研究對林麝腸源和圈舍土源大腸埃希菌進行分離鑒定，同時對鑒定出的71株大腸埃希菌進行藥敏試驗，根據藥敏試驗結果設計出12對引物，并對其進行耐藥性和耐藥基因的檢測。以期得到二者之間的聯系，探究耐藥基因是否有可能在兩者之間相互轉移，從而為林麝養殖過程中大腸桿菌病的防治、用藥以及控制大腸桿菌耐藥性提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Luria-Bertani(LB)培養基、麥康凱培養基、Mueller-Hinton(MH)培養基、Eosin-Methylene Blue(EMB)培養基、Tryptic Soy Agar(TSA)培養基、細菌微量生化鑒定管以及藥敏紙片等均購自杭州微生物試劑有限公司；2×TaqPCR MasterMix Kit、糞便基因組DNA提取試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化試劑(北京)有限公司；PCR反應的引物合成以及產物測序，均由杭州有康生物科技有限公司完成。

1.2 糞便和土壤樣品采集

采集茂縣、都江堰、理縣、陜西、瀘定、漢源林麝養殖場林麝66份新鮮糞便及養殖場20份土壤樣本，送往四川農業大學動物醫學院動物檢疫試驗室進行大腸埃希菌的分離鑒定。

1.3 大腸埃希菌的分離

將采集到的林麝新鮮糞便及養殖場土壤樣本劃線接種于EMB和TSA培養基，于37 ℃培養箱16～24 h，根據菌落形態特征以及革蘭染色結果，挑取單菌落進一步純化、保存。

1.4 生化試驗

依據《伯杰氏細菌鑒定手冊》[12]開展試驗，生化鑒定具體操作步驟按照說明書進行。

1.5 16S rRNA基因擴增與測序

采用細菌DNA提取試劑盒提取分離菌基因組DNA，作為PCR反應模板。選用16S rRNA基因通用引物27F和1492R進行PCR擴增。反應體系：2×TaqPCR MasterMix 25 μL，27F和1492R引物(10 mmol/L)各2 μL，DNA模板 1 μL，加ddH2O補足50 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃恢復延伸5 min，4 ℃保存。PCR產物電泳后進行測序，并將測序結果進行在線比對分析。

1.6 藥敏試驗

取保存菌株，接種于LB培養基中，37 ℃下180 r/min震蕩培養18～24 h。用0.5麥氏比濁管與LB培養基內的菌液進行對比，將其濃度調至1.5×108CFU/mL。在整個MH培養基表面均勻涂布菌液。采用Kirby-Barer紙片法[14]，將12種標準藥敏紙片貼在培養基上培養，觀察并測量抑菌圈直徑大小，重復3次并記錄。結果判定參照CLSI鑒定手冊(2017版)[15]進行。

1.7 大腸埃希菌耐藥基因的檢測

分別提取各分離株DNA作為模板進行耐藥基因 PCR檢測。引物序列及片段長度見表1。將陽性擴增產物進行序列測定，將結果與 GenBank上已發表的16S rRNA基因序列進行對比。

表1 12種耐藥基因的PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 大腸埃希菌的分離鑒定結果

2.1.1 大腸埃希菌的分離及生化鑒定 從采集的林麝新鮮糞便樣品66份，土壤樣品20份中分離出林麝腸源大腸埃希菌59株，圈舍土源大腸埃希菌12株。菌株在EMB培養基上呈現有特殊的綠色金屬光澤；在TSA培養基上為無色透明大菌落；革蘭染色陰性。

經生化鑒定發酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖和甘露醇產酸產氣，靛基質試驗、M.R.試驗均為陽性；V-P試驗、枸櫞酸鹽利用試驗均為陰性，符合大腸埃希菌的生化特征。

2.1.2 大腸埃希菌的16S rRNA PCR測序鑒定 分離的菌株經PCR擴增后均能見到一條大小約1 600 kp的條帶(圖1)。將測序結果與GenBank上已發表的16S rRNA基因序列進行對比，與MK506924.1序列的一致性達100%，鑒定結果表明71株菌均為大腸埃希菌。

M.DL 2000 相對分子質量標準；1.陰性對照；2～6.大腸埃希菌16S rRNA擴增產物

2.2 不同來源大腸埃希菌的藥敏檢測結果

2.2.1 林麝腸源大腸埃希菌和土源大腸埃希菌藥敏檢測結果 對于林麝腸源大腸埃希菌，僅有亞胺培南1種藥物對59例菌株高敏感度達 100.00%，占總藥物的8.33%；其次是氧氟沙星、氨曲南、諾氟沙星、頭孢他啶、多粘菌素，高敏感度均高于90.00%，占總藥物的41.67%；慶大霉素、氯霉素、頭孢唑林，高敏感度高于80.00%，占總藥物的25.00%；四環素高敏感度為76.27%，鏈霉素高敏感度為61.02%。但氨芐西林的耐藥率為81.36%。

對于圈舍土源大腸埃希菌，僅有亞胺培南1種藥物對12種菌株高敏度達100.00%，占總藥物的8.33%；其次是頭孢他啶、頭孢唑林、諾氟沙星、氧氟沙星、多粘菌素、氯霉素，高敏感度均為91.67%，占總藥物的50.00%；慶大霉素、氨曲南2種藥物，高敏感度為83.33%，占總藥物的 16.67%；鏈霉素、四環素2種藥物，高敏感度為 66.67%。但氨芐西林的耐藥率為91.67%。不同來源大腸埃希菌的藥敏檢測結果見表2。

表2 腸源和土源大腸埃希菌分離菌株藥敏試驗結果

2.2.2 不同林麝場大腸埃希菌耐藥檢測結果 在檢測的6個林麝場中，可見林麝腸源大腸埃希菌耐藥的林麝場數明顯多于圈舍土壤環境，同一類藥物在不同地區對于林麝不同來源大腸埃希菌耐藥性的表現基本一致(表3)。在檢測的12種藥物當中，可見不同林麝場中林麝腸源大腸埃希菌對藥物的耐藥性由高到低為氨芐西林、鏈霉素、四環素和氯霉素。

表3 不同林麝場大腸埃希菌菌株藥敏試驗結果

2.3 不同來源大腸埃希菌耐藥基因的檢測結果

2.3.1 耐藥基因PCR擴增產物的電泳結果 以提取的71株大腸埃希菌基因組DNA為模板，分別對12種耐藥基因進行PCR擴增。最終得到的核苷酸片段大小有9種，與預期結果相符。電泳圖如圖2～圖10。

M.DL 2000 marker；1.陰性對照；2～4.攜帶floR基因的分離株

M.DL 2000 marker；1～3,6.攜帶blaCTX-M基因的分離株；4～5.陰性對照

M.DL 2000 marker；7.陰性對照;1～6.攜帶 ant(3)-la基因的分離株

M.DL 2000 marker; 1～8.攜帶Cat基因的分離株

M.DL 2000 marker；2.攜帶 tet(C)基因的分離株；1、3、4.陰性對照

M.DL 2000 marker;1～5,7～9.陰性對照;6,10攜帶 aac(3)-lia基因的分離株

M.DL 2000 marker；1.陰性對照；2～6.攜帶 aac(6′)-Ib-cr基因的分離株

M.DL 2000 marker；1、2、5.陰性對照；3、4、6.攜帶tet(B)基因的分離株

M.DL 2000 marker；2、3、5.陰性對照；1、4.攜帶blaTEM基因的分離株

2.3.2 耐藥基因PCR擴增產物測序及分析 將各陽性擴增產物的序列測定結果與GenBank中的相應序列進行比較(表4)，發現各擴增產物與相應的耐藥基因有很高的同源性(≥99%)。

表4 PCR產物與GenBank中耐藥基因同源性比較

2.3.3 不同來源大腸埃希菌耐藥性表型和基因型的關系 由表5可知，林麝腸源大腸埃希菌中除2株菌(菌株編號為32和46)外，有57株菌至少含有1種耐藥基因，占所有菌株的比例為 96.61%，對于林麝腸源大腸埃希菌，大多數氨基糖苷類抗生素、單環內酰胺類抗生素等的耐藥性均不同程度低于相應基因的陽性率。而對于圈舍土源大腸埃希菌，氯霉素類檢出耐藥率為0，但耐藥基因陽性率不為0；氨基糖苷類抗生素、氟喹諾酮類抗生素等耐藥率高于耐藥基因的檢出率。

表5 腸源及土源大腸埃希菌耐藥性表型和基因型的關系

2.3.4 不同來源大腸埃希菌的多重耐藥基因型 由表6可知，在分離出的71株大腸埃希菌中，大多數表現為多重耐藥基因攜帶。腸源性大腸埃希菌中除2株菌(菌株編號32和46)外，有57株菌至少含有一種耐藥基因，占所有菌株的比例為96.61%(57/59)，而含有兩種以上多重耐藥基因的菌株比例為72.88%(43/59)，大部分菌株含多重耐藥基因的數量為2～3種，最多的達到7種(菌株編號112)。同時含有耐藥基因ant(3)-la、blaCTX-M、Cat的菌株檢出率最高。圈舍土源大腸埃希菌中除1株菌(菌株編號76)外，有11株菌至少含有1種耐藥基因，占所有菌株的比例為91.67%(11/12)，而含有兩種以上多重耐藥基因的菌株比例為66.67%(8/12)，大部分菌株含多重耐藥基因的數量為2種，最多的達到3種(菌株編號65)。同時含有耐藥基因blaCTX-M、Cat的菌株檢出率最高。

表6 不同來源大腸埃希菌多重耐藥基因型統計

3 討 論

3.1 大腸埃希菌耐藥表型及耐藥基因分析

從檢測的12種耐藥基因中，擴增到9種耐藥基因。檢測結果發現，大腸埃希菌耐藥基因的攜帶情況較為嚴重。另外，檢出率較低的耐藥基因有qnrB、tet(D)和tet(E)等，很大可能的原因是各養殖場在選用藥物時較少選用喹諾酮類和四環素類藥物[25]。

目前，對于大腸埃希菌病的治療，主要運用的藥物即抗菌類藥物，包括氨基糖苷類、氟喹諾酮類等[26]。在青霉素類藥物中，大腸埃希菌對氨芐西林的耐藥性較高[27]，與本試驗結果相符。也正是由于各類抗菌藥物的過度使用甚至濫用，導致大腸埃希菌對于各類藥物都產生了不同程度的耐藥性[28]。

3.2 耐藥表型與耐藥基因檢測結果的比較

由藥敏試驗結果，從耐藥表型較高的藥物種類選取了5類藥物的12種耐藥基因檢測，發現耐藥表型和耐藥基因的符合率在不同抗生素種類間以及不同來源大腸埃希菌間存在差異。

在林麝腸源大腸埃希菌中，可見四環素、諾氟沙星、鏈霉素符合率高，分別為63.16%、50.00%、25.81%；慶大霉素、氨曲南符合率較低，為9.68%和2.70%。在圈舍土源大腸埃希菌中，可見慶大霉素和鏈霉素符合率較高，均為 100.00%，其余藥物種類符合率均較低；同時，試驗中有檢測到細菌耐藥，而沒有檢測到相關耐藥基因的情況，在四環素類耐藥的大腸埃希菌中，并未檢測出耐藥基因。這提示除了目前發現的耐藥基因之外尚有其他耐藥機制的存在，細菌耐藥性的存在機制十分復雜[29]。有的細菌雖然檢測到耐藥基因，但其相關的耐藥表型并不表現。這與多種物質對基因在動物體內的表達調控有關[30]。

符合率較低的原因可能與耐藥基因存在及其翻譯表達的機制[27]有關，或與藥物存在的多種耐藥機制有關。此外，上述情況存在的原因還可能是細菌存在適應性耐藥機制，當細菌長久處于抗菌藥物環境時，可產生耐藥表型，但本身卻不具備該種藥物的基因[31]。這些機制主要有：細菌細胞膜的主動外排機制[32]；細菌外膜和脂多糖的增厚，使細胞膜流動性降低，增加藥物進入細菌的濃度[33]；細菌外膜上的轉運蛋白結構發生變化[34]等。

3.3 腸源性大腸埃希菌耐藥性與圈舍土壤環境大腸埃希菌的關系

對于耐藥基因而言，林麝腸源大腸埃希菌與土源大腸埃希菌差異性較大，林麝腸源大腸埃希菌耐藥基因檢出率普遍多于土源大腸埃希菌。除blaCTX-M、floR外，其余各耐藥基因均表現為林麝腸源大腸埃希菌耐藥基因檢出率大于土源大腸埃希菌。如ant(3)-la林麝腸源大腸埃希菌檢出率為45.76%，而土源大腸埃希菌檢出率為 8.33%。

但從耐藥基因整體結果來看，林麝腸源大腸埃希菌與土源大腸埃希菌又存在一致性，若某種耐藥基因在林麝腸源大腸埃希菌中陽性較多，則其在土源大腸埃希菌中的陽性結果相較于其他耐藥基因，也是偏多的。如Cat在腸源大腸埃希菌檢出率為44.07%，在土源大腸埃希菌檢出率為33.33%，它們始終保持著較為一致的變化趨勢。另外，從不同地區林麝圈舍的腸源大腸埃希菌和土源大腸埃希菌耐藥性分析，其分布特點具有地區特異性，但二者之間亦存在一致性。這從一定程度上表明林麝腸源大腸埃希菌與其生存的周圍環境存在著某種相互影響的關系，存在林麝腸源大腸埃希菌的耐藥基因與土源大腸埃希菌已有相互轉移的可能，憑借其所攜帶的質粒等遺傳載體，除了在菌株與菌株之間，也可能在不同物種、不同動物個體或不同菌種之間相互傳遞，從而使基因在水平上傳遞擴散[35]。