‘煙73’葡萄果皮花色苷合成、修飾與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)

田萌勃，鄭茗源，徐國前，惠竹梅,3

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750000；3.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100)

花色苷(Anthocyanin)是一種黃酮類化合物，除了在植物授粉和種子傳播方面起作用外，最重要是作為植物色素使葡萄表現(xiàn)出各種顏色[1]。花色苷主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成與修飾，轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡內(nèi)發(fā)揮生理功能。因此研究花色苷合成，修飾與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)與花色苷積累關(guān)系不僅有助于理解花色苷修飾與液泡轉(zhuǎn)運(yùn)，還有助于解析植物次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

花色素是一種黃酮類化合物，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，一般會(huì)在類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UDPG-flavonoid-3-O-glycosyltranferase, UFGT)作用下與一分子或幾分子糖以糖苷鍵形式結(jié)合，合成產(chǎn)物就是花色苷[2]。甲基轉(zhuǎn)移酶(O-methyltransferase, OMT)可將由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine, SAM)提供的甲基轉(zhuǎn)移至花色苷B環(huán)羥基上，增加花色苷結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[3-4]，部分花色苷還會(huì)被酰基轉(zhuǎn)移酶修飾為酰化花色苷。最終各種修飾程度花色苷被轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中積累[5]。關(guān)于花色苷轉(zhuǎn)運(yùn)，目前共發(fā)現(xiàn)3種模型：(1)由谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase, GST)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)：GST催化谷胱甘肽(GSH)與花色苷共價(jià)結(jié)合，形成谷胱甘肽共軛復(fù)合體(Glutathione S-conjugate)，隨后在液泡膜上的多藥耐藥相關(guān)蛋白(Multidrug Resistance-related Protein, MRP)作用下將谷胱甘肽共軛復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡內(nèi)[6-11]。多種GST基因家族包括玉米BZ2[12]、矮牽牛AN9[13]、擬南芥TT19[14]等被證實(shí)參與花色苷轉(zhuǎn)運(yùn)；(2)由多藥和有毒化合物排出家族(Multidrug and toxic compound extrusion, MATE)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)：MATE介導(dǎo)花色苷跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制依賴于H+/Na+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，ATP存在時(shí)，液泡膜上的MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用膜兩側(cè)H+/Na+濃度梯度作為推動(dòng)力，將花色苷向液泡內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)將質(zhì)子泵出液泡外[15-17]。擬南芥TT12編碼MATE型蛋白已被證實(shí)參與種皮中花色苷積累[18]，苜蓿中MATE2編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以轉(zhuǎn)運(yùn)包括花色苷在內(nèi)多種黃酮類化合物[19]；(3)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)[20-22]。

盡管葡萄花色苷合成、修飾與轉(zhuǎn)運(yùn)完整通路已被建立[23]，但‘煙73’作為富含花色苷的染色葡萄品種，果皮中與花色苷有關(guān)基因的表達(dá)模式及其與花色苷積累關(guān)系尚未見報(bào)道，本試驗(yàn)選取釀酒葡萄品種‘煙73’為材料，在分析‘煙73’葡萄果實(shí)基本品質(zhì)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過分析果皮中與花色苷合成、修飾與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)水平及其與花色苷積累關(guān)系，以探討染色葡萄品種花色苷代謝規(guī)律，為植物次生代謝產(chǎn)物合成、修飾與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)于2018年在寧夏塞上江南酒莊(寧夏回族自治區(qū)青銅峽市小壩鎮(zhèn)，105.52°E, 38.03°N)進(jìn)行，供試材料為釀酒葡萄染色品種‘煙73’是中國張?jiān)９疽浴媳比癁槟副尽ⅰ倒逑恪癁楦副荆?jīng)多年選育而成的優(yōu)質(zhì)染色葡萄品種。2016年定植，南北行向，株行距1 m×2.5 m，樹形采用“廠”字形。選擇樹勢中庸、掛果一致的植株，采用正常田間管理，葡萄成熟期氣候與往年相同。

樣品采集從花后8周(轉(zhuǎn)色期前)開始，每隔2周采1次樣，直至采收。采樣依據(jù)對角線法則。隨機(jī)選取并標(biāo)記10棵葡萄樹，為了使取樣具有代表性，分別在每棵葡萄樹上、中、下部隨機(jī)各選取1穗葡萄，然后分別在每穗葡萄上、中、下部各隨機(jī)選取3粒葡萄，共選取10棵果樹30穗葡萄，共計(jì)270粒葡萄。隨機(jī)選取50粒迅速用液氮冷凍處理，隨后放入-80 ℃冰箱保存，剩余220粒存入-20 ℃冰箱。

1.2 理化及多酚指標(biāo)測定

隨機(jī)選取100粒葡萄，揉碎過濾取汁，測定果汁可溶性固形物含量(手持糖度計(jì)法)、可滴定酸含量(以H2SO4計(jì)，g·L-1，NaOH滴定法)和pH(pH計(jì)法)。葡萄果皮單寧、總酚、總花色苷的測定參考樂小鳳等[24]的方法。

1.3 基因表達(dá)分析

表1 用于實(shí)時(shí)定量PCR的引物

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，用Duncan’s新復(fù)極差法比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄理化和多酚指標(biāo)

‘煙73’葡萄果實(shí)在轉(zhuǎn)色過程中的基本理化指標(biāo)見表2，可溶性固形物及果汁pH基本呈逐漸上升趨勢，成熟期(花后18周)含量分別為(23.50±0.30)%及3.59±0.10。可滴定酸含量逐漸下降，從花后8周的(25.50±0.17)g·L-1下降至成熟期的(3.22±0.03)g·L-1。

表2 不同成熟期果實(shí)理化指標(biāo)

‘煙73’葡萄果皮多酚指標(biāo)見圖1，隨著果實(shí)成熟，果皮中總酚、花色苷含量呈先上升后小幅下降趨勢，單寧含量總體呈下降趨勢。成熟期果皮總酚、單寧和花色苷含量分別為66.76 mg·g-1、22.32 mg·g-1和46.49 mg·g-1。葡萄理化和多酚指標(biāo)說明該地區(qū)‘煙73’葡萄成熟度好，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

圖中不同小寫字母表示同一指標(biāo)不同時(shí)期的差異達(dá)到顯著性水平(P<0.01)，下同

2.2 果皮花色苷合成，修飾與轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)量

VviUFGT調(diào)控葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，使花色素與糖結(jié)合成花色苷，VviOMT調(diào)控甲基轉(zhuǎn)移酶，參與花色苷甲基化進(jìn)程。因此對VviUFGT和VviOMT及可能參與花色苷轉(zhuǎn)運(yùn)的VviGST和AM進(jìn)行熒光定量PCR分析。由圖2可見，‘煙73’葡萄果皮中，VviUFGT、VviGST1、VviGST2、VviGST3、VviGST4表達(dá)量先上升，在花后10周達(dá)到最高值后逐漸下降，在花后 12～14周變化差異基本不顯著。VviOMT表達(dá)量呈下降趨勢，花后8周和10周表達(dá)量較高，且與其他時(shí)期存在顯著性差異。AM1與AM3表達(dá)量呈“M”型變化，在花后10周和14周表達(dá)量較高，并與其他時(shí)期存在顯著性差異。

圖2 不同成熟期‘煙73’果皮中花色苷相關(guān)基因相對表達(dá)量

2.3 花色苷積累量與基因表達(dá)水平的相關(guān)性

為了解這8個(gè)基因與花色苷積累量之間共同變化趨勢，對‘煙73’不同成熟期果皮花色苷積累量和8個(gè)花色苷合成、修飾與轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析(表3)。結(jié)果表明，在‘煙73’品種中，這8個(gè)基因都與花色苷積累量呈正相關(guān)，其中VviGST1和VviGST2與花色苷積累量呈顯著相關(guān)，VviGST3、VviGST4與花色苷積累量呈極顯著正相關(guān)。說明這4個(gè)基因都參與花色苷的液泡轉(zhuǎn)運(yùn)，特別是VviGST3、VviGST4發(fā)揮了主要作用。VviOMT與VviGST1顯著相關(guān)，說明VviGST1與花色苷的甲基化有關(guān)。

表3 ‘煙73’果皮花色苷積累量與基因表達(dá)量間相關(guān)性

3 討 論

釀酒葡萄只有具備一定含量的可溶性固形物，同時(shí)具備一定含酸量，才有釀造優(yōu)質(zhì)葡萄酒潛力。酚類物質(zhì)是一類重要植物次生代謝產(chǎn)物，可以保護(hù)植物機(jī)體內(nèi)生物大分子免受氧化損傷[26]，也是鑒定葡萄成熟情況的重要指標(biāo)。寧夏賀蘭山東麓地區(qū)光熱條件好，日較差大，葡萄生長季干旱少雨，十分利于葡萄生長以及糖類物質(zhì)，多酚物質(zhì)的積累。該地區(qū)‘煙73’可溶性固形物含量適中，可滴定酸含量較低，說明葡萄果實(shí)理化成熟度較好。果皮多酚物質(zhì)與其他歐亞種葡萄如‘蛇龍珠’‘梅鹿輒’等相比，總酚和單寧含量是其5～10倍[24, 27]。同時(shí)‘煙73’作為染色品種，成熟期果皮總花色苷含量達(dá)到52.49 mg·g-1，也遠(yuǎn)高于其他紅色釀酒葡萄品種，具有較高紅葡萄酒調(diào)色價(jià)值[28]。綜上，本地區(qū)‘煙73’葡萄果實(shí)品質(zhì)較好，成熟度較高。

Pilati等[29]通過基因組分析表明，“轉(zhuǎn)色前期”是細(xì)胞代謝的重組階段，伴隨著大量激素傳導(dǎo)和眾多基因表達(dá)。因此本試驗(yàn)所測8個(gè)與花色苷合成、修飾與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因在轉(zhuǎn)色前期表達(dá)量較高。其中VviUFGT調(diào)控類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)催化不穩(wěn)定的花色素糖苷化形成各種類型花色苷，是花色苷生物合成途徑中最關(guān)鍵的酶[30]。在本試驗(yàn)中，‘煙73’UFGT表達(dá)量在花后8～10周迅速上升，果皮總花色苷在這段時(shí)期也迅速積累，兩者具有較高相關(guān)性，這證明了UFGT對花色苷合成的調(diào)控作用[3]。O-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT)催化花青素-3-O-葡萄糖苷和花翠素-3-O-葡萄糖苷甲基化，生成甲基花青素、甲基花翠素和二甲基花翠素葡萄糖苷。‘煙73’VviOMT相對表達(dá)水平較高，說明‘煙73’葡萄果皮中甲基化花色苷含量較高，同時(shí)與其他7個(gè)基因不同，VviOMT在花后8周的表達(dá)量最高，說明在花后8周時(shí)VviOMT還參與除花色苷外其他黃酮類化合物的甲基化進(jìn)程，這也在Kim等[31]和Cho等[32]的研究中得到驗(yàn)證。GST是與花色苷轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的酶，GST家族基因可以分為Phi、Zeta、Theta、Tau、DHAR和Lambda亞類，其中Phi和Tau類GST為植物中特有[33]。VviGST1是與BZ2高度同源的Tau類GST，有報(bào)道表明VviGST1可以在與GSH結(jié)合情況下轉(zhuǎn)運(yùn)包括花色苷在內(nèi)多種黃酮類化合物[9]，本試驗(yàn)中，VviGST1與花色苷積累相關(guān)，說明VviGST1參與花色苷轉(zhuǎn)運(yùn)，并且其與控制花色苷甲基轉(zhuǎn)移酶基因VviOMT的相關(guān)性系數(shù)說明VviGST1可能參與甲基化花色苷轉(zhuǎn)運(yùn)，這是關(guān)于GST家族基因?qū)ㄉ辙D(zhuǎn)運(yùn)的新見解，但其對甲基化花色苷的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。VviGST3和VviGST4是Phi類GST，通過分子對接分析表明，此類GST主要轉(zhuǎn)運(yùn)原花色素等黃酮類化合物，還能協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)GSH，但其對花色苷轉(zhuǎn)運(yùn)不依賴GSH，并且響應(yīng)不同信號刺激[8]，因此VviGST3和VviGST4相對表達(dá)量遠(yuǎn)高于VviGST1是轉(zhuǎn)運(yùn)原花色素、轉(zhuǎn)運(yùn)GSH等物質(zhì)以及兩者的結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致。關(guān)于VviGST2的研究較少，本試驗(yàn)中VviGST2與VviUFGT、VviGST1和VviGST3的表達(dá)模式呈極顯著相關(guān)，說明VviGST2在參與花色苷轉(zhuǎn)運(yùn)同時(shí)，可能還參與原花色素轉(zhuǎn)運(yùn)。所有4個(gè)GST家族基因在轉(zhuǎn)色期相對表達(dá)量共同達(dá)到最高值，因此花色苷合成與轉(zhuǎn)運(yùn)在時(shí)空上可能具有較高的協(xié)同性。葡萄MATE型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因anthoMATE(AM)同源于擬南芥TT12，定位于液泡膜并負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)花色苷特別是酰化花色苷[15]，本試驗(yàn)中AM1與AM3在轉(zhuǎn)色期表達(dá)趨勢相近，說明AM1與AM3在轉(zhuǎn)色期發(fā)揮相近功能，但未見AM1或AM3與花色苷積累量相關(guān)，這可能是花色苷酰化進(jìn)程與總花色苷積累趨勢的差異導(dǎo)致，若能監(jiān)測轉(zhuǎn)色期酰基轉(zhuǎn)移酶活性或其對應(yīng)基因表達(dá)量變化趨勢，則能較好地解釋AM對酰化花色苷的轉(zhuǎn)運(yùn)作用。

4 結(jié) 論

本研究通過分析‘煙73’葡萄理化、多酚物質(zhì)含量，同時(shí)分析與花色苷合成、修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)水平，以期為染色葡萄花色苷代謝通路提供理論基礎(chǔ)。結(jié)果表明，成熟期‘煙73’理化及多酚成熟度較好，在葡萄酒生產(chǎn)中有較高調(diào)色價(jià)值。基因表達(dá)水平與花色苷積累的相關(guān)性分析顯示，VviUFGT調(diào)控果皮中花色苷合成。GST家族基因參與果皮花色苷轉(zhuǎn)運(yùn)，并且VviGST1與VviOMT的相關(guān)系數(shù)顯示，VviGST1可能參與甲基化花色苷的轉(zhuǎn)運(yùn)。