中溫條件下添加磁鐵粉對(duì)麥稈厭氧發(fā)酵特性的影響

冉薛伶,曾瑞媛,王燕子，王彥博，王曉嬌，任成杰，楊改河，任廣鑫

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西省循環(huán)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100；3.扶風(fēng)縣扶風(fēng)高中，陜西扶風(fēng) 722200)

秸稈是中國主要農(nóng)業(yè)廢棄物，全國秸稈理論資源量為10.4億t，國家發(fā)改委和農(nóng)業(yè)部聯(lián)合印發(fā)的《關(guān)于編制“十三五”秸稈綜合利用實(shí)施方案的指導(dǎo)意見》(發(fā)改辦環(huán)資[2016]2504號(hào))提出到2020年全國秸稈綜合利用率要達(dá)到85%以上[1]。厭氧發(fā)酵(Anaerobic digestion，AD)不僅可以對(duì)農(nóng)業(yè)廢棄物進(jìn)行有效處理，同時(shí)還可以產(chǎn)生新能源-甲烷，是一種有效處理秸稈的方式。秸稈含有較高的纖維素和碳，利用秸稈進(jìn)行厭氧發(fā)酵效果并不理想[2]，如何利用厭氧發(fā)酵高效高產(chǎn)的處理秸稈成為一個(gè)熱點(diǎn)問題。

Fe元素對(duì)厭氧發(fā)酵效率以及系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定性有著重要影響[3-8]。Patel等[9]研究表明，在水葫蘆-牛糞的發(fā)酵過程中添加FeCl3可以使沼氣產(chǎn)量增加60%以上。蔡曉陽等[10]研究表明添加適量的Fe3O4NPs有助于提高大豆蛋白廢水厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣量。汪琪等[11]研究得出適量Fe2+可促進(jìn)污泥的厭氧發(fā)酵。但目前通過添加Fe元素來優(yōu)化麥稈厭氧發(fā)酵效率的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)在中低溫條件下比較添加不同劑量磁鐵粉對(duì)麥稈厭氧發(fā)酵過程中的pH、堿度、甲烷產(chǎn)量、脫氫酶活性(DHA)、纖維素酶活性(CEA)的影響，旨在考察Fe元素在不同溫度下對(duì)麥稈厭氧發(fā)酵特征指標(biāo)的影響，為秸稈厭氧發(fā)酵高產(chǎn)工藝?yán)碚撗芯亢蜕a(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥秸稈來自西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥種植地，自然風(fēng)干后切成2～3 cm小段。發(fā)酵接種物取自楊凌示范區(qū)崔西溝村正常發(fā)酵池的沼液。磁鐵粉產(chǎn)自攀枝花市，先將其粉碎并篩分至粒徑約 0.5～1.0 mm，然后用超純水清洗后，在110 ℃烘箱內(nèi)烘10 h。通過原子吸收光譜法(Hitachi-Z5000，日本)測(cè)量磁鐵粉特性。發(fā)酵原料特性與磁鐵粉中金屬成分質(zhì)量占比如表1和表2所示。

表1 發(fā)酵原料特性

表2 磁鐵粉中金屬元素含量

1.2 試驗(yàn)方法

以麥稈為發(fā)酵原料，采用Zhang[12]所研究的方法進(jìn)行批次試驗(yàn)。反應(yīng)在1 000 mL研磨瓶中進(jìn)行，其發(fā)酵體系物質(zhì)為700 g(500 g發(fā)酵物質(zhì)和200 g接種物)，總含固率調(diào)配成8%。在不同溫度(20、25、30、35 ℃)下分別向反應(yīng)瓶中加入不同劑量磁鐵粉0、2、4、6、8 g/L，分別記錄為T20、T25、T30、T35和W0、W2、W4、W6、W8。每組試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)。為保證底物均勻混合，每天定時(shí)手動(dòng)搖晃所有發(fā)酵瓶1～2 min。

1.3 測(cè)量指標(biāo)

發(fā)酵體系含固率(TS)、揮發(fā)性固體含量(VS)、總氮(TN)和總碳(TC)、pH、堿度，采用美國公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)方法[13]，測(cè)量取樣時(shí)間為發(fā)酵進(jìn)行的1、6、11、16、21、31、36、41、46、51 d。

采用排水法測(cè)定每日產(chǎn)生的沼氣體積，并用氣體成分分析儀測(cè)定甲烷比例(Gasboard-3200p，武漢)。

每5 d測(cè)量1次CEA和DHA。纖維素酶活性采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)染色法進(jìn)行測(cè)量并計(jì)算出纖維素酶含量[14]。脫氫酶活性通過碘化四硝基氯化物(INT)法進(jìn)行測(cè)量[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理和計(jì)算，采用生態(tài)學(xué)多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析工具CANOCO 5.0進(jìn)行冗余分析(Redundancy analysis,RDA)。利用SPSS 26.0進(jìn)行相關(guān)性分析。基于試驗(yàn)得到的累計(jì)甲烷產(chǎn)量(M)，用修訂的Gompertz模型[16]預(yù)測(cè)厭氧發(fā)酵過程中累計(jì)產(chǎn)甲烷潛力(Q)、停滯期(n)、發(fā)酵周期(t)等參數(shù)，方程表述如下：

M=Q·exp{-exp[R·e·(n-t)/Q+1]}

其中，R為最大日產(chǎn)甲烷生成速率；e是常數(shù)，約為2.718 3。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磁鐵粉添加量對(duì)厭氧發(fā)酵主要特征指標(biāo)的影響

2.1.1 對(duì)pH的影響 由圖1可以看出，發(fā)酵體系的pH在不同溫度下添加磁鐵粉的表現(xiàn)規(guī)律是一致的，均表現(xiàn)為下降-升高-保持的趨勢(shì)。在不同的發(fā)酵溫度下，添加磁鐵粉后，pH表現(xiàn)為前期下降與后期上升速率都很快，說明添加磁鐵粉明顯有利于厭氧發(fā)酵的水解-酸化-產(chǎn)氣過程[17]。隨著溫度升高，pH降至最低點(diǎn)所需的發(fā)酵時(shí)間減少，且在35 ℃時(shí)，pH降至最低點(diǎn)所需的時(shí)間最少，表明在該溫度下其水解-酸化過程比其他溫度下更快。在此過程之后，pH增加到最高點(diǎn)并且趨于穩(wěn)定。在35 ℃下進(jìn)行的厭氧發(fā)酵，其最高pH達(dá)到7.4，明顯高于其他溫度下的處理，表明較高溫度可以促進(jìn)發(fā)酵反應(yīng)更快更好地進(jìn)行。在溫度為35 ℃時(shí)，pH最高值和最低值之前的差值最大，尤其是在添加2 g/L磁鐵粉的情況下，pH變化最快。在整個(gè)厭氧發(fā)酵過程中，不管溫度如何變化，對(duì)照組的pH總是相對(duì)較低，而處理組W2、W6和W8的變化明顯。

圖1 不同溫度下厭氧發(fā)酵過程的pH

2.1.2 對(duì)堿度的影響 由圖2可知，在20～ 35 ℃的發(fā)酵條件下，堿度均呈現(xiàn)出先下降后逐漸回升至穩(wěn)定狀態(tài)的情況，說明整個(gè)發(fā)酵體系具備相應(yīng)的緩沖能力去維持系統(tǒng)穩(wěn)定[18]，而溫度為 35 ℃時(shí)，整個(gè)發(fā)酵過程中堿度保持逐漸上升的趨勢(shì)。然而，對(duì)照組W0的堿度值總是較低，表明其體系穩(wěn)定性不如處理組，說明加入磁鐵粉能提高麥稈發(fā)酵系統(tǒng)的緩沖能力，從發(fā)酵的第16天堿度開始逐漸上升，最后保持穩(wěn)定。在發(fā)酵開始階段堿度的組間差異并不明顯，當(dāng)反應(yīng)穩(wěn)定之后，由于磁鐵粉添加量不同，組間呈現(xiàn)出明顯差異。在不同溫度下，添加相同劑量的磁鐵粉也會(huì)產(chǎn)生不同的效果。在溫度為25 ℃時(shí)，W2和W6的堿度高于W0和W8。而在溫度為35 ℃時(shí)，W8的堿度值較大,可達(dá)1 537 mg/L，W6的堿度值最小，為2 200 mg/L。

圖2 不同溫度下厭氧發(fā)酵過程的堿度

2.1.3 對(duì)CH4產(chǎn)量的影響 由圖3可知，隨著溫度上升，厭氧發(fā)酵的停滯期逐漸縮短，開始產(chǎn)CH4的時(shí)間提前。當(dāng)溫度為20 ℃時(shí)，各組開始產(chǎn)CH4的時(shí)間在28～33 d，其中對(duì)照組W0的停滯期最長為36 d，W8的停滯期最短為14 d，說明低溫下發(fā)酵系統(tǒng)啟動(dòng)較慢，且添加磁鐵粉可以促進(jìn)秸稈厭氧發(fā)酵的啟動(dòng)。同時(shí)，W0的累計(jì)CH4產(chǎn)量最低，說明添加磁鐵粉會(huì)增加累計(jì)CH4產(chǎn)量(圖4)。在溫度為25 ℃時(shí)，各組在第20天開始產(chǎn)CH4，相比20 ℃提前了10 d，同時(shí)從第37天開始出現(xiàn)產(chǎn)CH4高峰期，W0的累計(jì)甲烷CH4最低，開始穩(wěn)定產(chǎn)CH4的時(shí)間最遲。W4的日CH4產(chǎn)量最大，累計(jì)CH4產(chǎn)量(ACH4)最高。在溫度為30 ℃時(shí)，產(chǎn)CH4時(shí)間出現(xiàn)在15～16 d，各處理日甲烷CH4均緩慢上升，W4和W6的累計(jì)CH4產(chǎn)量較高，但W4的日CH4產(chǎn)量在第16天之后開始急劇上升，并在第22天達(dá)到整個(gè)發(fā)酵過程的峰值，日CH4產(chǎn)量最大值為290 mL，W6的日CH4產(chǎn)量一直穩(wěn)定上升，在第39天才達(dá)到最大值。對(duì)照組W0在發(fā)酵25 d后才逐漸開始產(chǎn)CH4，且累計(jì)CH4產(chǎn)量仍然處于最低水平。在溫度為 35 ℃時(shí)，各組在第4天～第5天開始產(chǎn)CH4，第一次產(chǎn)CH4高峰期出現(xiàn)在第12天～第13天，各組停滯期較其他溫度的處理有明顯縮短。其中，W2在第12天出現(xiàn)產(chǎn)CH4高峰。在整個(gè)發(fā)酵過程中，最大日CH4產(chǎn)量可達(dá)373 mL。組間累計(jì)CH4產(chǎn)量差異較為明顯，W2的累計(jì)CH4產(chǎn)量最高為5 497 mL，表明磁鐵粉對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)CH4量的影響較大。

圖3 不同溫度下不同磁鐵粉添加量厭氧發(fā)酵過程中日CH4產(chǎn)量

圖4 不同溫度下不同磁鐵粉添加量處理下厭氧發(fā)酵過程中累計(jì)甲烷產(chǎn)量

在中低溫條件下，秸稈厭氧發(fā)酵隨著溫度的增加，反應(yīng)啟動(dòng)得更快。這是因?yàn)閰捬醢l(fā)酵是由一系列酶促反應(yīng)組成的，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度的增加可以導(dǎo)致酶活性的增強(qiáng)，從而使得厭氧發(fā)酵速率更快。磁鐵粉的添加可以增加發(fā)酵過程中的CH4產(chǎn)量，表明磁鐵粉可以促進(jìn)厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷菌的生長繁殖，提升甲烷菌的活性。

2.2 不同磁鐵粉添加量對(duì)厭氧發(fā)酵生物酶活性變化的影響

在厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中，脫氫酶作為一種重要的功能酶，與細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化過程密切相關(guān)[15,19]，在一定程度上其活性可以反映發(fā)酵體系中的底物被微生物降解的程度[20]。一氧化碳脫氫酶以Ni-Fe形式存在，可以加快乙酸被產(chǎn)甲烷菌消化生成甲烷的速率[21]；發(fā)酵底物經(jīng)脫氫酶催化，使該酶的受體NAD(P)+被還原為 NAD(P)H，而Fe2+這種還原劑正可協(xié)助還原反應(yīng)的發(fā)生，從而提高酶活性[22]。本試驗(yàn)中磁鐵粉作為添加劑，測(cè)量脫氫酶活性可以進(jìn)一步探討Fe元素對(duì)厭氧發(fā)酵過程的有效性。

在秸稈發(fā)酵過程中，產(chǎn)甲烷的速率很大程度上取決于纖維素被分解的速率[23]。纖維素和木質(zhì)素能有效地被纖維素酶降解[24]。因此，纖維素酶活性也是體現(xiàn)厭氧發(fā)酵效果的一個(gè)重要指標(biāo)[25]。司振軍[26]研究表明Fe2+的添加可以增加纖維素酶的活性。因此，本研究測(cè)量纖維素酶活性旨在探究磁鐵粉的添加對(duì)厭氧發(fā)酵過程的 影響。

2.2.1 對(duì)脫氫酶活性的影響 DHA可以反映厭氧發(fā)酵體系中微生物的活性[27]。從不同溫度下厭氧發(fā)酵過程中脫氫酶活性的變化(圖5)可以看出，隨著溫度的增加，DHA逐漸上升，各溫度下的DHA均呈現(xiàn)出升-降-升的趨勢(shì)。當(dāng)溫度為 20 ℃，第16天時(shí)，除W2以外，各組均達(dá)到第一次峰值，其中處理組W8上升到最高值為863 UI。也許是因?yàn)榇盆F粉的加入增強(qiáng)了微生物的活性，因而表現(xiàn)出DHA的上升。而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，在第41天～第46天時(shí)，達(dá)到第二次高峰。其中，W4處理組的DHA變化較小，當(dāng)發(fā)酵結(jié)束時(shí)，仍然維持在較高水平數(shù)值為669 UI，而W8已經(jīng)降到最低點(diǎn)為197 UI。當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，組間兩次峰值數(shù)值差異較小，其中W4在第二次峰值的數(shù)據(jù)最大為1 156 UI。在溫度為30 ℃時(shí)，第二次峰值明顯大于第一次，但各組間數(shù)值變化趨勢(shì)差異較小，其中W2的DHA最高，為1 516 UI，而對(duì)照組W0在各時(shí)期的數(shù)值均為最低，表明磁鐵粉的添加可以提升DHA，從而提高微生物活性。當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，W8的DHA達(dá)到 1 536 UI，表明溫度上升可以促進(jìn)微生物活性。

圖5 不同溫度下厭氧發(fā)酵過程脫氫酶活性

2.2.2 對(duì)纖維素酶活性的影響 由圖6所示，當(dāng)發(fā)酵溫度為20 ℃時(shí)，在發(fā)酵初期各組CEA均逐漸降低。在發(fā)酵進(jìn)行到第26天時(shí)，CEA急劇上升。第31天～第36天，CEA出現(xiàn)最大值，說明在 20 ℃下發(fā)酵啟動(dòng)時(shí)間較長，麥稈水解過程較緩慢。在發(fā)酵后期，W6達(dá)到最大值。溫度在 25 ℃時(shí)，CEA大體呈現(xiàn)為先升高后降低，且波動(dòng)較大。在第11天W8出現(xiàn)了峰值，此后持續(xù)降低直到發(fā)酵結(jié)束。在溫度為30 ℃時(shí)，各試驗(yàn)組的CEA均高于20～25 ℃下的CEA，并且在發(fā)酵的第6天～第21天都呈現(xiàn)出較高的酶活性狀態(tài)。第21天～第41天，各組的CEA急劇下降，之后開始回升并保持穩(wěn)定，其中W4的CEA較其他組明顯更低。CEA在溫度為35 ℃下的變化趨勢(shì)與在30 ℃的變化一致，但組內(nèi)峰值差異較大，W6出現(xiàn)峰值的時(shí)間最晚且峰值最大，證明W6的底物水解較晚但水解速率較快。

圖6 不同溫度下厭氧發(fā)酵過程纖維素酶活性

2.3 冗余分析和相關(guān)性分析

利用冗余分析(RDA)對(duì)酶活性和溫度、磁鐵粉、pH、堿度、日CH4產(chǎn)量和累計(jì)CH4產(chǎn)量之間的相關(guān)性進(jìn)行檢驗(yàn)。如圖7所示，CH4、堿度、溫度和pH對(duì)酶活性的解釋率大于20%(P= 0.002)，是影響酶活性的主要因子。其中纖維素酶的活性與磁鐵粉相關(guān)，也許是因?yàn)镕e元素參與纖維素酶的合成[28]。隨著纖維素酶活性增強(qiáng)，可以溶解更多的底物，導(dǎo)致厭氧發(fā)酵體系中小分子酸增多，甲烷菌可利用的前體物質(zhì)增加，從而提高秸稈厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣量。脫氫酶活性與堿度和累計(jì)甲烷產(chǎn)量明顯相關(guān)，可能是因?yàn)榛|(zhì)脫氫這一化學(xué)反應(yīng)主要依靠脫氫酶，如果脫氫酶活性不足，厭氧發(fā)酵后續(xù)的產(chǎn)氫反應(yīng)將會(huì)嚴(yán)重受阻[19]，進(jìn)而影響CH4產(chǎn)量。

ALK.堿度；ACH4.累積甲烷產(chǎn)量

溫度和磁鐵粉添加量的不同使得試驗(yàn)中的pH、堿度、CH4產(chǎn)量以及酶活性都產(chǎn)生變化，但是通過雙因素相關(guān)性分析(表3)可得出溫度與pH、堿度、日CH4產(chǎn)量、累計(jì)CH4產(chǎn)量以及纖維素酶活性之間的關(guān)系十分顯著，與脫氫酶活性關(guān)系顯著。這是因?yàn)闇囟壬仙沟妹富钚栽鰪?qiáng)，加快了反應(yīng)的進(jìn)行，從而使得pH等指標(biāo)發(fā)生改變。磁鐵粉與堿度之間的關(guān)系十分顯著，表明磁鐵粉的添加可以增強(qiáng)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定性。總體來說，溫度與各指標(biāo)之間的相關(guān)性明顯強(qiáng)于磁鐵粉，溫度是影響該試驗(yàn)最關(guān)鍵的因素，這與冗余分析的結(jié)果對(duì)應(yīng)。有研究表明發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)最適合于牛糞中溫厭氧發(fā)酵微生物菌群的生長，使得發(fā)酵啟動(dòng)最快[29]。磁鐵粉和溫度二者的交互作用對(duì)pH和堿度的相關(guān)性十分顯著，與累計(jì)CH4產(chǎn)量的相關(guān)性顯著。

表3 溫度(T)和磁鐵粉雙因素相關(guān)性分析

2.4 動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化分析

厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣過程的變化可以被認(rèn)為是微生物生長變化的函數(shù)[30]。從擬合結(jié)果(表4)可以看出，各處理厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣特性基本上與模型擬合度較高(R2>0.98)，可以反映出體系中底物成分無差異，且添加磁鐵粉后對(duì)體系的穩(wěn)定性有促進(jìn)作用。停滯期是反映厭氧消化性能的一個(gè)重要指標(biāo)。模型結(jié)果(表4)表明，隨著溫度的升高，停滯期逐漸縮短，并且從整體趨勢(shì)來看，累積甲烷產(chǎn)氣潛力也明顯增加。在35 ℃下，添加磁鐵粉后厭氧發(fā)酵停滯期縮短，但磁鐵粉添加過量后停滯期反而增長，說明適量磁鐵粉有利于反應(yīng)體系中厭氧微生物的增殖和活化，從而提高對(duì)底物的轉(zhuǎn)化效率，這與T90的變化一致，但過量的磁鐵粉會(huì)抑制微生物活性及基質(zhì)的代謝從而造成產(chǎn)氣量降低[31]。

表4 不同溫度下厭氧發(fā)酵過程預(yù)測(cè)的模型參數(shù)

采用序列綜合法對(duì)各溫度下麥稈厭氧發(fā)酵過程中累積CH4產(chǎn)量、停滯期、發(fā)酵周期以及前期所分析的pH、堿度、CH4產(chǎn)量、DHA、CEA等指標(biāo)進(jìn)行分析，可得出麥稈在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃發(fā)酵過程中，最佳磁鐵粉添加量分別為8、6、4、2 g/L。

3 結(jié) 論

在麥稈厭氧發(fā)酵過程中，添加適量磁鐵粉可以使得發(fā)酵過程中pH下降和回升速率更快，加快了發(fā)酵系統(tǒng)的啟動(dòng)，同時(shí)使得堿度上升較快并且更易維持穩(wěn)定，增大發(fā)酵系統(tǒng)的緩沖力，可以促進(jìn)秸稈厭氧發(fā)酵的產(chǎn)甲烷量，同時(shí)可以增強(qiáng)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中酶活性。綜上所述，麥稈在20～35 ℃進(jìn)行厭氧發(fā)酵時(shí)，磁鐵粉最適添加量分別為8、6、4、2 g/L，累積甲烷產(chǎn)量分別提高154%、103%、160%、10.2%。磁鐵粉對(duì)麥稈在不同溫度下的厭氧發(fā)酵過程中DHA與CEA有一定促進(jìn)作用，且與CEA的相關(guān)性大于DHA。但是DHA與發(fā)酵過程中的堿度、甲烷產(chǎn)量之間的相關(guān)性大于CEA。但添加的磁鐵粉中也含有其他極少量微量金屬元素，可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果也有影響，同時(shí)試驗(yàn)未探究更高溫度下磁鐵粉對(duì)厭氧發(fā)酵特性及酶活性的影響，會(huì)在今后的研究中補(bǔ)充完善。