芝麻繁育特性研究Ⅴ：花粉活力與柱頭可授性

孫 建，魏 星，樂美旺，饒月亮，顏廷獻(xiàn)，顏小文，梁俊超，周紅英

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所，國家油料改良中心南昌分中心，江西省油料作物生物學(xué)重點實驗室，南昌 330200；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070)

芝麻(SesamumindicumL.)隸屬于胡麻科胡麻屬，是古老而優(yōu)質(zhì)的重要油料作物，分布非常廣泛，熱帶、亞熱帶、溫帶等區(qū)域均有種植，幾乎栽培于中國所有省份。有活力的花粉、有效的媒介和有可授性的柱頭是植物生殖成功，實現(xiàn)有性繁殖的前提條件，也是植物生殖生物學(xué)的重要研究內(nèi)容[1-3]。已有的研究表明，芝麻是以自交為主的具有較高天然異交率的植物，異交率為5%～23%[4-5]，特殊情況高達(dá)65%[6]。以蜜蜂為主的傳粉昆蟲是芝麻異花授粉的主要媒介[7-8]。芝麻花粉與柱頭接觸后5～10 min開始萌發(fā)，15～30 min大量萌發(fā)，2 h后生長最快的花粉管抵達(dá)花柱基部，花粉管伸長速度約3.0～4.7 mm/h，授粉后4～6 h大量花粉管進(jìn)入子房完成受精[9-10]。理論上，一粒花粉即能夠讓一個胚珠受精發(fā)育成一粒種子[11]。然而，關(guān)于芝麻花粉活力和柱頭可授性這兩個生殖生物學(xué)重要內(nèi)容的研究報道很少。僅僅在花粉育性的檢測上參考其他作物采用了I2-KI染色法[12-13]、醋酸洋紅染色法[14]等方法，尚未有較系統(tǒng)的研究。本研究比較分析直接觀察法、醋酸洋紅染色法、I2-KI染色法、無機(jī)酸法、MTT染色法、TTC染色法和FDA熒光檢測法等7種方法在芝麻花粉活力上的檢測效果，并監(jiān)測花粉活力的日變化情況，采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法和不同時間直接授粉法對芝麻柱頭可授性的日變化進(jìn)行研究，以期豐富芝麻繁育和生殖生物學(xué)內(nèi)容，為芝麻種子繁育及生殖發(fā)育等相關(guān)研究提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料為芝麻品系‘贛芝928’，夏季種植于江西省農(nóng)科院作物研究所試驗基地，種植行距40 cm，株距15 cm，田間管理如常。種子均由江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 花粉活力的不同檢測方法 試驗采取以下7種花粉活力檢測方法，花粉采集于盛花期 8:00-11:00。顯微觀察在OLYMPUS BX51熒光生物顯微鏡下進(jìn)行，在200×視野下觀察并計算花粉數(shù)目，每個樣品隨機(jī)觀察10個視野以上，累計觀測花粉粒200粒以上，重復(fù)3次。

花粉活力=具有活力花粉數(shù)量/總花粉數(shù) 量×100%

(1)直接觀察法：將采取的花粉直接置于載玻片上，滴加1滴清水后蓋上蓋玻片，直接置于顯微鏡下觀察，形態(tài)皺縮不規(guī)則的為沒有活力花粉。

(2)醋酸洋紅染色法：該方法的染色原理是靠花粉中的脫氫輔酶而染色，有活力的花粉被染成紅色，無活力或敗育的花粉染色淺或無色[15]。采取的新鮮花粉置于載玻片，滴加φ=1%醋酸洋紅染色液蓋片后置于顯微鏡下觀察[16]。染色液配制方法為將1 g洋紅加入到100 mLφ=45%的醋酸溶液中，煮沸后將生銹鐵釘放入10～30 s左右取出，冷卻過濾，遮光保存，備用[17-18]。

(3)I2-KI染色法：淀粉遇碘變藍(lán)，根據(jù)染色程度判斷花粉粒中的淀粉含量，從而確定花粉活性。采取新鮮花粉置于雙凹載玻片，滴加I2-KI染色液后，于30 ℃恒溫箱培養(yǎng)30 min后，在顯微鏡下觀察，有活力的花粉染色較深，呈藍(lán)褐色，活力衰弱或內(nèi)含物少的著色較淺，呈黃褐色。I2-KI染色液的配制方法為取1.3 g KI溶于水，再加0.3 g碘，定容至100 mL，置棕色瓶，備用[19]。

(4)無機(jī)酸法：由于酸對花粉粒質(zhì)膜的刺激作用，使質(zhì)膜變得非常脆弱，通透性增大，以致大量地吸收H+，使內(nèi)壓迅速升高并導(dǎo)致質(zhì)膜膨脹，最后活性花粉的胞質(zhì)內(nèi)含物噴射出來，形成“瞬時花粉管”[20-21]。取新鮮花粉置于雙凹載玻片上，滴加0.8 mol/L的硝酸溶液，室溫放置5～10 min后顯微鏡觀察，有活力的花粉胞質(zhì)內(nèi)含物噴射而形成瞬時花粉管[21]。

(5)MTT(噻唑藍(lán))染色法：有活力花粉細(xì)胞中的脫氫酶將MTT染色液還原成藍(lán)紫色或紅褐色結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中，而無活力或敗育的花粉則染色淺或無色[22]。利用w=5%的蔗糖溶液配制w=1%的噻唑藍(lán)染色液，采取新鮮花粉置于雙凹載玻片上，滴加MTT染色液后，室溫放置30 min后顯微鏡觀察，花粉著色深，呈紅褐色的為有活力花粉[18,22]。

(6)TTC(氯化三苯基四氮唑)染色法：氯化三苯基四氮唑是氧化還原色素，其水溶液無色，遇到活細(xì)胞中的脫氫酶(NADH和NADPH)而接受氫離子還原后生成不溶于水的三苯甲酯，呈紅色[23-24]。采取新鮮花粉置于雙凹載玻片上，滴加φ=0.5%TTC溶液，35 ℃恒溫箱培養(yǎng)15 min后顯微鏡觀察，著色為紅色或紅褐色的為有活力花粉，著色淺和不著色的為無活力或不育花粉[25]。0.5%TTC溶液的配制方法為0.5 g TTC加少許φ=95%酒精溶解后，用蒸餾水稀釋至100 mL，遮光保存，備用[25]。

(7)熒光檢測法(FDA法)：熒光素二醋酸酯(FDA)本身不產(chǎn)生熒光，可以自由透過完整的原生質(zhì)膜，進(jìn)入有活性的細(xì)胞原生質(zhì)后能被酯酶分解形成能產(chǎn)生熒光的熒光素，熒光素不能自由出入原生質(zhì)膜，便在有活性的細(xì)胞內(nèi)積累，而無活性的細(xì)胞則不產(chǎn)生熒光[23,26]。用0.5 mol/L的蔗糖溶液配制0.1 g/L的FDA溶液，采取新鮮花粉置于雙凹載玻片上，滴加FDA溶液后，于30 ℃恒溫箱培養(yǎng)15～20 min后在熒光顯微鏡下觀察，有活力的花粉將發(fā)出熒光[27]。

1.2.2 花粉活力日變化檢測方法 于盛花期選擇晴好天氣的7:30-17:30每隔2 h采集新鮮花粉進(jìn)行花粉活力的日變化觀測，采用MTT染色法，在200×顯微鏡下隨機(jī)觀察10個視野以上，觀察并計算花粉數(shù)目，累計觀測花粉粒200粒以上，共觀測3 d，視為3次重復(fù)。

1.2.3 柱頭可授性的測定方法 采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性[28-30]。選取當(dāng)天開放的花朵，取柱頭前段，放入200 μL離心管中，加入50 μL聯(lián)苯胺-過氧化氫反應(yīng)液[1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22(體積比)]。若柱頭具可授性，呈現(xiàn)出過氧化物酶活性，則過氧化氫分解，聯(lián)苯胺被氧化，則柱頭周圍的反應(yīng)液有氣泡出現(xiàn)，根據(jù)氣泡產(chǎn)生的快慢和多少確定柱頭可授性等級，并記錄相應(yīng)得分[2]。分級標(biāo)準(zhǔn)為：1級，有較少氣泡，具有低可授性，計1分；2級，具有較多氣泡，具有中等可授性，計2分；3級，有連續(xù)大量氣泡，具有高可授性，計3分(圖1所示)。測定時間為芝麻盛花期的7:30-17:30，每隔2 h測1次，每次測10個正在開放花朵的柱頭，共觀察 3 d，視為3次重復(fù)。

A為3級，具有大量氣泡，計3分；B為2級，具有較多氣泡，計2分；C為1級，具有較少氣泡，計1分

1.2.4 不同授粉時間下的相對結(jié)實率日變化監(jiān)測方法 于盛花期選擇晴好天氣，于前一天傍晚17:00左右對芝麻次日即將開放的花朵進(jìn)行去雄去花冠處理，并吊牌做好標(biāo)記。次日清晨7:30左右收集剛開放的新鮮花粉(帶花冠一起采集)，放置于墊有濕紙巾的密封盒內(nèi)，再將密封盒放在 10～15 ℃保存(筆者課題組實驗證明該方法可以高活力保存芝麻花粉12 h以上)。將采集的花粉于 7:30-17:30時每隔2 h對前一天已去雄的柱頭進(jìn)行授粉，每次授粉柱頭數(shù)30個左右，并在吊牌上標(biāo)記好授粉時間和授粉柱頭數(shù)。共重復(fù)3 d該試驗，視為3次重復(fù)。待蒴果成熟后，收獲標(biāo)記了的蒴果，統(tǒng)計蒴果數(shù)和每蒴粒數(shù)，計算結(jié)蒴率和相對結(jié)實率。計算公式為：結(jié)蒴率=(有效蒴果數(shù)/標(biāo)記授粉柱頭數(shù))×100%，有效蒴果是指含有正常籽粒的蒴果；相對結(jié)實率=(測定粒數(shù)/蒴果數(shù))/對照的每蒴粒數(shù)×100%，對照的每蒴粒數(shù)是指自然授粉狀態(tài)下的每蒴粒數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析均在Excel 2007和SPSS 18.0軟件上進(jìn)行，圖表制作在Excel 2007和Adobe Photoshop CS2軟件上完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻花粉活力不同檢測方法的比較

(1)不作處理的直接觀察法的結(jié)果如圖2-A所示，芝麻花粉主要呈顏色較深且形狀圓形或卵圓形、顏色淺且形態(tài)圓形或卵圓形、顏色淺且形態(tài)不規(guī)則等3種類型，難以判定花粉活力，因此，該方法不適合芝麻花粉活力檢測。

(2)醋酸洋紅染色法染色效果十分明顯，如圖2-B，具活力的花粉被染成紅褐色，形狀呈圓形或卵圓形，而形狀不規(guī)則且不著色或著色淺的花粉即為不具活力的花粉粒。該方法操作簡單，染色效果好，容易判別。試驗中測定花粉活力為 93.89%。

(3)I2-KI染色法在芝麻花粉活力檢測中出現(xiàn)著色深且形狀圓形或卵圓形、著色淺且形狀圓形或卵圓形、不著色或著色淺且形狀不規(guī)則等3種類型的花粉粒(圖2-C)，第一種著色深且形狀規(guī)則的可視為有活力花粉，后一種類型可以判定為沒有活力花粉，但中間類型的著色深淺則較難判別。因此，該方法可以用來測定芝麻花粉活力，但判定標(biāo)準(zhǔn)難以把握。試驗中以著色深和著色淺且形狀規(guī)則的花粉粒視為有活力花粉粒，測定的花粉活力為94.87%。

(4)無機(jī)酸法在芝麻花粉粒活力檢測中的結(jié)果顯示(圖2-D)，在無機(jī)酸溶液處理下，花粉粒胞質(zhì)內(nèi)含物噴射形成“瞬時花粉管”，是一種可行的花粉活力檢測方法。但觀察時間受到限制，時間過短還沒有形成“瞬時花粉管”而無法觀察，時間過長則花粉胞質(zhì)內(nèi)含物噴射過多而無法判定。因此，無機(jī)酸法可以檢測芝麻花粉粒活力，但操作不方便，不是最佳選擇。試驗中測定的花粉活力為93.18%。

(5)MTT法在芝麻花粉粒檢測中的染色效果如圖2-E所示，供試花粉粒出現(xiàn)著色深且形狀圓形或卵圓形、著色淺且形狀圓形或卵圓形、不著色或著色淺且形狀不規(guī)則等3種類型的花粉粒，第一種著色深且形狀規(guī)則的花粉類型可視為有活力花粉，后一種類型可判定為沒有活力花粉，而中間類型則難以判別。因此，該方法可以用來測定芝麻花粉活力，但判定標(biāo)準(zhǔn)難以統(tǒng)一把握，結(jié)果準(zhǔn)確性存在偏差。試驗中以著色深和著色淺且形狀規(guī)則的花粉粒為有活力的花粉粒，測定的花粉活力為94.63%。

(6)TTC法在芝麻花粉活力檢測時出現(xiàn)所有花粉粒著色均勻一致，如圖2-F，從顏色上難以判定花粉著色差異，但花粉形狀上有差異，與未作處理直接觀察的方法類似，因此該方法不適合芝麻花粉粒活力檢測。

A.直接觀察法；B.醋酸洋紅染色法；C.I2-KI染色法；D.無機(jī)酸法；E.MTT染色法；F.TTC染色法。標(biāo)尺.100 μm

(7)FDA熒光檢測法在芝麻花粉活力的檢測中的結(jié)果顯示(圖3)，所有花粉粒均有熒光發(fā)出，形狀明顯皺縮不規(guī)則的花粉粒發(fā)射的熒光亮度比正常花粉粒偏強(qiáng)，可能是由于花粉壁皺縮重疊使FDA溶液蓄積偏多所致。因此，F(xiàn)DA熒光檢測法不適合芝麻花粉粒活力的檢測。

A.普通光學(xué)視野下的花粉粒；B.熒光視野下的花粉粒；標(biāo)尺：100 μm

綜上，直接觀察法、TTC染色法和FDA熒光檢測法均不能用于芝麻花粉活力的檢測。在用醋酸洋紅染色法、I2-KI 染色法、無機(jī)酸法和MTT染色法獲得的花粉粒活力的結(jié)果分別是 93.89%、94.87%、93.18%和94.63%，數(shù)據(jù)差別不大，差異主要來自著色深淺標(biāo)準(zhǔn)的把握上。可見，以上4種方法均能用于芝麻花粉活力檢測，其中，無機(jī)酸法操作不簡便，I2-KI 染色法和MTT染色法存在一定的著色深淺標(biāo)準(zhǔn)的判別差異，而醋酸洋紅法操作簡單、判別標(biāo)準(zhǔn)明顯。

2.2 芝麻花粉活力的日變化動態(tài)

盛花期的芝麻雄蕊散粉時間與溫度、濕度等天氣情況有關(guān)，一般溫度較高的晴朗天氣散粉時間較早，早晨6:00以后就開始散粉，至7:30花藥已經(jīng)完全裂開；空氣濕度較大的陰雨天氣，花藥開裂散粉的時間較晚，有時延遲到9:00。選擇3個晴朗的天氣測定的花粉活力日變化結(jié)果顯示，如圖4所示，芝麻花粉活力在7:30-9:30最高，達(dá)到93.04%和92.06%，11:30后開始顯著下降，從80.49%(11:30)逐漸下降到40.30%(17:30)。同時，在檢測過程中發(fā)現(xiàn)，芝麻花粉量在7:30-9:30時最大，隨后由于昆蟲活動和自身散落的原因開始不斷減少，11:30時花粉大量散失，13:30時花粉剩余量較少，15:30時僅在花藥壁和花粉囊兩端存在部分花粉，在17:30時剩余花粉數(shù)量很少，絕大部分花粉散失貽盡。而且芝麻花粉散失的時間與空氣濕度、氣溫等關(guān)系很大，陰雨高濕天氣時，17:30時花藥上的花粉量依然很大。

不同小寫字母表示在0.05水平上的差異顯著。下同

2.3 基于聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定的柱頭可授性日變化動態(tài)

根據(jù)柱頭與聯(lián)苯胺-過氧化氫反應(yīng)后出現(xiàn)氣泡的速度和數(shù)量，以1～3級來評價芝麻柱頭可授性檢測日變化情況，結(jié)果如圖5所示。芝麻柱頭可授性總體呈先升后降的趨勢，7:30時柱頭已經(jīng)具備較高的可授性，評分達(dá)2.77，隨后繼續(xù)升高至9:30的2.80，在11:30以后表現(xiàn)出隨時間推延顯著下降的趨勢，由11:30的2.73下降到 13:30的2.47，隨后急劇下降至15:30的1.67和17:30的1.27。發(fā)育過程中，芝麻在開花前12 h已經(jīng)具備比較高的可授性，此時授粉能夠有較高的結(jié)實率。另外，授粉后的芝麻柱頭在下午時就開始出現(xiàn)不同程度的自然脫落，且受天氣因素的影響較為明顯。而未授粉的柱頭自然脫落的時間要晚很多，當(dāng)天脫落的概率較小，同樣受天氣影響較大。

圖5 芝麻柱頭可授性的日變化進(jìn)程

2.4 不同時間授粉的結(jié)實率日變化動態(tài)

一般情況下，芝麻花粉在柱頭萌發(fā)并成功受精發(fā)育成種子時，子房才能生長膨大發(fā)育成蒴果，而在沒有花粉萌發(fā)受精或柱頭沒有可授性的情況下，子房不會膨大生長成蒴果，而是自然脫落。因此，結(jié)蒴率和相對結(jié)實率均與柱頭可授性有直接關(guān)系。芝麻不同時間授粉的結(jié)蒴率和相對結(jié)實率的日變化結(jié)果如圖6顯示，芝麻的結(jié)蒴率隨時間推延而不斷下降，早上7:30具有最高的結(jié)蒴率(97.38%)，17:30時結(jié)蒴率下降至68.51%。而相對結(jié)實率在7:30-11:30差異不明顯，均處在較高狀態(tài)，為91.76%～92.52%，13:30后開始顯著下降，由13:30的84.46%下降到17:30的 59.37%。試驗中，對開花前12 h左右，即開花前一天的17:30左右在柱頭上也進(jìn)行了授粉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)蒴率在71.67%，相對結(jié)實率可以達(dá)到 54.42%，這為科研中特殊情況下的應(yīng)急授粉提供了參考。

圖6 芝麻不同時間授粉的結(jié)蒴率和相對結(jié)實率的日變化進(jìn)程

2.5 相關(guān)分析

對花粉活力、柱頭可授性、結(jié)蒴率和相對結(jié)實率的日變化數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)分析，結(jié)果顯示(表1)，4個指標(biāo)之間的相關(guān)性均呈極顯著正相關(guān)，其中柱頭可授性與相對結(jié)實率的相關(guān)系數(shù)最大，達(dá)0.940。可見，本試驗中測定的芝麻4個指標(biāo)的日變化趨勢高度一致，均隨時間的推延而降低，上午是芝麻傳粉受精的最佳時間。

表1 芝麻4個日變化指標(biāo)的相關(guān)分析結(jié)果

3 討 論

3.1 芝麻花粉活力檢測方法與日變化

植物花粉活力的測定方法很多，染色法和無機(jī)酸法等快速測定法無疑是最為簡單而常用的方法。但是不同方法的檢測原理不同[31-32]，適用的范圍也不同，不同種類植物的花粉自身結(jié)構(gòu)特性和內(nèi)含物也存在較大差異，因此，不同植物需要根據(jù)自身的特征特性選擇合適的花粉活力檢測方法[21,33-34]。在菊屬植物中的研究認(rèn)為I2-KI染色法、TTC染色法、無機(jī)酸法和熒光染色法都不適合其花粉活力檢測[27]。苧麻的花粉活力檢測方法比較研究認(rèn)為，I2-KI染色法、TTC染色法和醋酸洋紅染色法的檢測結(jié)果不理想[35]。在玉米花粉檢測時，認(rèn)為I2-KI染色法不適合玉米花粉活力檢測，TTC染色法最為簡單、準(zhǔn)確[36]。油菜花粉活力的檢測方法研究顯示，I2-KI染色法和TTC染色法測定結(jié)果可靠性低，醋酸洋紅染色法是油菜花粉活力最佳的檢測方法[15-16]。大花三色堇花粉活力測定研究認(rèn)為，I2-KI和醋酸洋紅適宜花粉活力的染色鑒定，而TTC則不能使花粉著色[37]。本研究結(jié)果顯示，直接觀察法、TTC染色法和FDA熒光檢測法均不能用于芝麻花粉活力的檢測，醋酸洋紅染色法、I2-KI 染色法、無機(jī)酸法和MTT染色法等4種方法均能用于芝麻花粉活力檢測，其中，無機(jī)酸法操作不簡便，I2-KI 染色法和MTT染色法存在一定的著色深淺標(biāo)準(zhǔn)的判別差異，而醋酸洋紅法操作簡單、判別標(biāo)準(zhǔn)明顯。這是因為I2-KI 和MTT染色效果受花粉壁結(jié)構(gòu)、內(nèi)含物含量等因素影響[22,38-39]，而存在花粉粒著色深淺有差異。

不同種類植物花粉活力與壽命也完全不同，如甘蔗的花粉活力在7:00-7:30時最高，13:00后活力喪失[40]；野生煙草和栽培煙草品種的花粉活力最高峰值均在13:00-15:00[2]；萬壽菊的花粉日變化為先升后降，11:00-13:00期間的活力最高[41]。本研究結(jié)果顯示，芝麻花粉活力在 7:30-9:30最高，11:30后開始顯著下降，傍晚花冠(含雄蕊)自行脫落，花粉活力基本喪失。另外，觀察發(fā)現(xiàn)，芝麻花粉活力的日變化也受天氣條件影響。該結(jié)果豐富了芝麻生殖生物學(xué)內(nèi)容，為良種繁育研究提供了參考。

3.2 芝麻柱頭可授性

柱頭是雌蕊接受花粉的重要部位，其表面形態(tài)和生理特征影響著花粉能否成功粘附、萌發(fā)和花粉管伸長，具有可授性的柱頭能夠粘附花粉，并為花粉萌發(fā)和花粉管伸長生長提供物質(zhì)供應(yīng)[42-43]。聯(lián)苯胺-過氧化氫法和直接授粉法是植物柱頭可授性研究的主要方法，已經(jīng)在很多植物中廣泛應(yīng)用[1-3,40-41]。本研究采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定的芝麻柱頭可授性的日變化表現(xiàn)為先升后降，且早晨7:30時已有很高的可授性，9:30時達(dá)到最高值，11:30后開始顯著下降。采用直接授粉法測得芝麻7:30時具有最高的結(jié)蒴率，7:30-11:30的相對結(jié)實率高，13:30后開始不斷顯著下降。聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定的柱頭可授性和直接授粉法測定的結(jié)蒴率、相對結(jié)實率均呈極顯著正相關(guān)，兩種方法測定的結(jié)果完全一致，說明聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定的芝麻柱頭可授性方法可行、結(jié)果可靠。同時，本研究認(rèn)為芝麻開花后直至上午11:30均是柱頭可授性最強(qiáng)的時期，中午后柱頭可授性快速下降，且芝麻柱頭在開花前 12 h左右已經(jīng)具有較好的可授性，這與前人的研究結(jié)果基本一致[44]。這為芝麻繁育和種子生產(chǎn)中的一些技術(shù)研究提供了理論參考。