使用茜素絡合物標記鳙耳石

劉 清，崔 玲，管永晶，潘建雄，岳小亞

(1.西安市水產工作站，西安 710054；2.西安市漁政監督管理站，西安 710054;3.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌 712100)

鳙(Aristichthysnobilis)屬于鯉科(Cyprinidae)、鰱亞科(Hypophthalmichthyinae)，俗稱大頭魚、花鰱、胖頭魚，是以浮游生物為食的濾食性魚類，是中國池塘養殖最喜愛配養魚種之一。因其較高的經濟價值及凈化水體的能力，鳙成為中國淡水水體大面積養殖的種類之一[1]。近年來，由于城市河流污染加重，野外魚類資源顯著減少[2-3]。魚類人工增殖放流是優化魚類資源和保護生態平衡的有效手段，而有效的標記方法是對人工增殖放流的技術保障和效果評價的前提[4]。熒光物質浸泡標記是一種能夠在短時間內實現大規模標記的技術，現階段已被廣泛應用于人工增殖放流活動[5]。茜素絡合物(Alizarin complexone,ALC)作為一種熒光標記化合物，具有成本低、標記時間存留長等優點，是評估放流效果的理想物質[6]。本研究選用不同質量濃度ALC溶液對不同飼養密度的鳙進行浸泡標記，確定合適的標記條件后進行放流回捕，確定ALC標記鳙的最適條件，并初步評估ALC作為鳙增殖放流的檢測效果，以期為鳙魚的大規模標記提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試劑

于西安市魚苗繁殖場購買孵化后10 d的鳙，試驗前于300 L玻璃水缸中暫養7 d以適應實驗室的試驗環境。暫養期間，每日9:00定時換水1 次，清理缸底糞便和雜質，換水量為1/3。以豐年蟲作為餌料，每日10:00和18:00定時投喂。光周期時間比例為14 h(明)∶10 h(暗)，水體溫度保持(25 ± 1)℃，溶解氧量6.5～7.5 mg/L，pH 7.4～7.9。用于標記的ALC(CAS: 3952-78-1)購于上海阿拉丁公司。

1.2 鳙耳石標記條件的優化

設置3個鳙飼養密度組，分別為20、40、50尾/L。每個飼養密度分別設置4個ALC浸泡質量濃度組，分別為0、50、100、200 mg/L，每組3個重復，浸泡時間設置為24 h和48 h。記錄ALC處理后養殖1個月內鳙的存活率。

1.3 耳石的摘取、處理和觀察

對ALC處理后飼養1周的鳙幼魚用MS-222麻醉，用解剖針和鑷子于解剖鏡下進行微耳石、星耳石、矢耳石的采集。用去離子水清洗去除附著在耳石表面的薄膜與雜質，再用無水乙醇進行脫水、干燥，置于載玻片上用透明指甲油封片固定。最后，用細砂紙對耳石進行仔細打磨至耳石輪廓清晰可見，置于熒光顯微鏡下進行觀察并拍照記錄。

1.4 鳙的大量標記、放流與回捕

確定ALC標記鳙的最適條件后，于2016年6月在西安市魚苗繁殖場對鳙進行大規模標記并在魚苗場暫養5個月。于11月3日和18日在灞河城市段的上游河段世博園處、中游河段浐灞交匯處和下游河段長安碼頭處分別進行放流，共放流標記鳙12.7萬尾和未標記鳙28.6萬尾。于2017年9-11月進行3次回捕，測量回捕的成魚體長和體質量，摘取微耳石，參照幼魚耳石的處理方法進行處理，使用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.5 數據統計分析

采用Excel 2013進行數據統計分析與制圖，數據以“平均值±標準誤”表示。用SPSS 22.0統計學軟件進行最小極差法LSD和單因素方差分析(One Way ANOVA)分析組間差異，P<0.05為顯著差異水平，P<0.01為差異極顯著水平。

2 結果與分析

2.1 熒光檢測耳石類型的確定、熒光顯微鏡激發光的選擇及熒光標記效果的等級界定

解剖獲得ALC標記后7 d的鳙幼魚(24日齡)耳石，用熒光顯微鏡觀察微耳石、星耳石、矢耳石。通過比較發現，微耳石的標記效果最好，星耳石次之，矢耳石最差(圖1)，表明鳙的微耳石是熒光檢測的最適耳石類型。為獲得效果良好的微耳石圖像，分別選用可見光、藍光、綠光和紫外光作為激發光進行觀察拍照。比較發現，藍光下微耳石的熒光標記最為清晰(圖1)。如圖2所示，根據付自東等[7]的方法，根據熒光環在可見光和3 種熒光下的大小及鮮艷程度，按 “+++”(鮮艷)、“++”(明顯)、“+”(可見)和“-”(不可見)4個等級記錄熒光標記強度。

箭頭.熒光標記環；A.微耳石；B.星耳石；C.矢耳石；1.藍光；2.可見光；3.綠光；4.紫外光

箭頭.熒光標記環；+++.鮮艷；++.明顯；+.可見；-.不可見;下同

2.2 ALC的質量濃度和鳙飼養密度的優化

通過對標記后7 d鳙幼魚(24日齡)微耳石的觀察發現，耳石的標記強度隨ALC質量濃度的升高而增大(圖3)。當ALC質量濃度達到100 mg/L時，40%～60%的微耳石熒光環呈“鮮艷”，且無不可見現象，表明ALC浸泡質量濃度為100 mg/L時可達到最佳熒光標記效果(表1)。當鳙飼養密度從20尾/L增至50尾/L時，各組耳石標記強度及成活率均無顯著差異，表明飼養密度對耳石標記效果無顯著性影響。在鳙的數量相同時，密度越小則試劑等成本耗費越多。因此將50尾/L定為最佳飼養密度(表1)。

圖3 飼養密度50尾/L時不同浸泡質量濃度下鳙微耳石在藍色熒光下的標記效果

表1 不同飼養密度下鳙微耳石的標記效果

2.3 ALC對鳙耳石標記最適浸泡時間的確定

比較ALC不同浸泡時間(24 h和28 h)對鳙耳石標記效果的差異，從而確定最適浸泡時間。ALC的質量濃度100 mg/L，鳙的飼養密度50尾/L，為最佳條件。由表2可知，相比于24 h浸泡組，48 h組中標記效果為鮮艷程度的比例較高，且更為明亮。因此，ALC對鳙耳石標記的最適浸泡時間是48 h。

表2 不同浸泡時間的標記效果

2.4 鳙放流回捕的耳石標記情況

在前期魚類調查中發現灞河城市段不存在野生鳙，在3次回捕中共捕撈到超過1年齡的鳙28尾，回捕率為0.006%～8%，其中有標記魚16尾，未標記魚12尾(圖4)。通過耳石鑒定年齡均為1+，符合鳙放流到回捕的時間間隔。因此，確定該28尾即為試驗放流的鳙。通過比較增殖放流前后鳙的肥滿度和每日增長率，結果表明，放流前后鳙的平均肥滿度均在2.0以上(除20日齡，1.34±0.035)，放流期間的增長率(68.53%)相較于放流前(0.00～21.75%)有很大提升。

箭頭.熒光標記環；A.標記魚；B.未標記魚

3 討 論

本研究根據付自東[7]熒光效果分類方式，結合實際的觀察效果，將耳石在可見光和3 種熒光下的標記效果分成4個等級。結果表明，微耳石在可見光下也能觀察到較淺的淡紅色標記環，在藍色熒光下觀察的耳石標記效果最好，這與Liu等[8]的研究結果相似。熒光物質會隨碳酸鈣積累于耳石處，逐漸形成熒光標記環，而新陳代謝的速度與碳酸鈣積累的速度緊密相關[9]。本研究標記的24日齡鳙幼魚處于代謝旺盛時期，攜帶熒光物質的碳酸鈣沉淀速度快，因此在耳石上形成了清晰的熒光標記環。

硬骨魚類的耳石存在于內耳的膜迷路內，由位于內耳的微耳石、橢圓囊的矢耳石和聽壺的星耳石3對耳石構成[10]，在魚體中起平衡和聽覺作用。耳石的主要成分是碳酸鈣，在魚體內穩定存在[11]，被熒光物質染色后可形成永久標記，因此耳石的熒光標記成為監測魚類增殖放流活動的有效手段。之前的研究表明，熒光物質對耳石的標記效果在不同魚種之間存在差異。用ALC標記不同魚種時，邱晨等[12]發現在鯉仔魚中星耳石的標記效果最好，而徐永江等[9]發現，ALC對半滑舌鰨的矢耳石的標記效果最好。本研究結果表明，ALC對鳙耳石標記效果為：微耳石的標記效果最好，星耳石次之，矢耳石的標記環紊亂，標記效果最差。因此認為采用ALC浸泡標記鳙時，微耳石是檢測標記效果最適合的耳石類型。宋昭彬等[13]用ALC標記鳡魚，微耳石標記效果最佳。由于熒光標記效果與耳石的打磨密切相關，而鳙和鳡魚微耳石輪紋規則清晰、幾乎不用打磨可能是導致微耳石良好標記效果的重要原因。

熒光浸泡標記法具有成本低、對機體損傷小且標記效果好的優點，被廣泛應用于魚類的大規模標記[14]。因此，優化熒光標志物對魚類標記的方法及過程十分有必要。通常以魚類的存活率和對耳石的標記效果來衡量熒光物質對魚類的最適標記條件[15]。除此之外，不同魚類對ALC的耐受程度不同，Liu等[8]發現用300 mg/L的ALC浸泡牙鲆時未出現死亡現象，而Walt等[16]發現浸泡虹鱒時，ALC達20m g/L時即大量死亡。本研究分別用0、50、100、200 mg/L的ALC浸泡標記鳙，發現耳石的標記效果隨著ALC質量濃度的增加而增強，這與Walt等[16]的研究結果一致。同時，隨著ALC質量濃度的增加，鳙的存活率有下降的趨勢。因此，綜合考慮存活率、標記效果和成本耗費等方面，本研究認為，用ALC浸泡標記鳙的最優質量濃度為100 mg/L。進一步探究ALC標記鳙時的最佳浸泡質量濃度與鳙的最適飼養密度，通過比較ALC浸泡后24 h與48 h鳙耳石的標記效果，發現ALC浸泡時間為48 h可達到最佳標記效果，此時鳙的存活率與24 h組相較并無顯著性降低。另外，鳙的飼養密度對ALC的熒光標記效果及鳙的存活率無顯著影響，出于節省勞動力、節省成本等經濟因素的考慮，鳙的飼養密度可確定為50尾/L。綜上可得，在鳙飼養密度為50尾/L的情況下，用100 mg/L的ALC浸泡鳙48 h即為ALC浸泡標記鳙的最適標記條件。

標記放流是一種評估增殖放流效果的常用方法[17]。劉奇[18]通過比較兩種最常用標記放流方法(標牌標記與熒光標記)對褐牙鲆的標記效果，發現熒光標記法對機體損傷較小，且通過該方式能夠準確獲得牙鲆的遷徙路線。本研究采用熒光標記放流的方式，通過統計回捕鳙的每日相對增長率和肥滿度評價鳙增殖放流后的生長情況，初步評估鳙在灞河城市段流域的放流效果。發現鳙在灞河城市段平均日增長率高、生長迅速，說明鳙作為濾食性魚類，在灞河城市段中浮游生物的攝食充分，對河流中氮磷提取作用顯著。魚體的肥滿度通常能夠反映其生長環境中餌料的豐富度。回捕鳙的肥滿度均在2.0以上，高于之前研究報道的生活于其他區域的鳙，如南四湖(1.7)[19]和泥河水庫(1.9)[20]，這表明鳙在灞河城市段流域生長狀況良好，ALC標記未對鳙的生長造成不良影響。另外，通過觀察放流1 a后的鳙耳石的標記環，發現標記環依然清晰可見，這表明ALC對鳙耳石具有良好的標記效果，能夠廣泛應用于鳙的增殖放流研究。