基于直接涂抹法的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜鑒定常見酵母樣真菌截斷值的確定及驗證

李艷君，薛 珊，董 蓉，趙強元

解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心 檢驗科，北京 100048

近年來，隨著腫瘤、艾滋病等免疫受損患者的增多，免疫抑制劑及廣譜抗生素的長期使用，介入治療手段的開展，真菌感染發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，尤其是侵襲性真菌感染，是感染性疾病死亡的主要原因之一[1-3]。真菌感染病原的快速鑒定對于臨床搶先實施抗真菌治療，降低病死率至關重要。近年來，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS) 突 破傳統(tǒng)方法鑒定耗時長、鑒定能力不足等弊端，在臨床得以廣泛應用[4-6]。然而由于前處理方法不同，儀器推薦的甲酸萃取法的截斷值一般不適用于常規(guī)直接涂抹法的真菌鑒定，給鑒定結果的判斷帶來一定困擾，因此有必要在各自實驗室條件下評價適宜的真菌鑒定截斷值。本研究對直接涂抹法進行酵母樣真菌MALDI-TOF-MS 鑒定的截斷值進行評價，詳述如下。

資料與方法

1 標本來源 2018 年1 月- 2019 年6 月我中心臨床送檢真菌培養(yǎng)樣本中分離培養(yǎng)出的酵母樣真菌共計494 株。

2 儀器與試劑 德國Bruker 公司的Microflex 系列MALDI-TOF 質(zhì)譜儀及配套的標準品、基質(zhì)液；法國梅里埃沙保羅真菌培養(yǎng)基；上海一恒MJ-II 霉菌培養(yǎng)箱。

3 真菌分離培養(yǎng) 臨床送檢樣本以三區(qū)劃線方式接種于沙保羅培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h，挑選乳酪樣純菌落進行后續(xù)實驗。

4 樣品制備 將純培養(yǎng)菌落用牙簽均勻涂抹于靶板上，加1μl 甲酸覆蓋，晾干后滴加1μl 基質(zhì)液，待其干燥后上機鑒定。

5 MALDI-TOF-MS 鑒定 打開Flexcontrol3.4 軟件，調(diào)節(jié)儀器參數(shù)，選擇377 nm 氮氣激光，線性陽離子檢測模式，質(zhì)荷比采集范圍2 000 ～ 20 000 Da，激光強度30%，每個樣本擊打5 個點，每點激光轟擊100 次，記錄鑒定結果和分值。

6 真菌18SrDNA 測序鑒定 所有菌株DNA 通過酵母菌基因組DNA 提取試劑盒進行提取，擴增引物序列為ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；擴增條件為95℃ 5 min，(95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃1 min)×30 循環(huán)，72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物上機測序，序列結果登錄NCBI 網(wǎng)站進行比對，獲得菌種鑒定結果。以18SrDNA 測序鑒定結果為金標準，質(zhì)譜鑒定結果與其一致時定義為鑒定正確。

7 數(shù)據(jù)分析 以質(zhì)譜鑒定分值為輸入數(shù)據(jù)，應用SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。繪制ROC 曲線，計算曲線下面積和約登指數(shù)，約登指數(shù)最大時對應的數(shù)值即為最佳截斷值。應用χ2檢驗比較不同截斷值鑒定的正確率和錯誤率。檢驗水準α=0.05。

結 果

1 MALDI-TOF MS 鑒定結果分析 與測序結果進行比對，494 株酵母樣真菌中，MALDI-TOF MS 鑒定正確27 種，463 株，正確率93.7%，鑒定分值1.301 ～ 2.235，見表1，鑒定錯誤31 株，占比6.3%，鑒定分值1.11～1.810，見表2。

表1 463 株鑒定正確的酵母菌種類及鑒定分值Tab. 1 Classification and identification scores of 463 corrected identified yeasts

表2 31 株鑒定錯誤的酵母菌種類及鑒定分值Tab. 2 Classification and values of 31 uncorrected identified yeasts

2 ROC 曲線分析結果 由上述資料知，鑒定正確的分值較高，錯誤的相對較低，提示鑒定分值的水平分布，可能與鑒定正確程度(正確率)有關。故進一步探討之。以鑒定正確的資料為陽性樣本(n=463)，以鑒定錯誤的資料為陰性樣本(n=31)，建立接收者工作特征曲線(receiver operation characteristic，ROC)診斷分析模型。并以質(zhì)譜鑒定分值為數(shù)據(jù)繪制ROC 曲線。結果：酵母樣真菌鑒定在不同臨界值時的敏感度、特異性及約登指數(shù)見表3。鑒定分值為1.6 時約登指數(shù)最大，為0.722，其對應的敏感度為0.86，特異性為0.88，ROC 曲線下面積為0.929，見圖1，故1.6 為最適宜截斷值。

3 不同截斷值鑒定結果的比較 經(jīng)實際測試，截斷值為2.0 時，鑒定正確正確率為7.5%。截斷值為1.6 時鑒定正確率77.7%。經(jīng)χ2檢驗，鑒定正確率差異有統(tǒng)計學意義，P ＜0.001，見表4。

圖 1 MALDI-TOF-MS鑒定酵母樣真菌的ROC曲線Fig. 1 ROC curve of yeast identification using MALDI-TOF-MS

表3 不同截斷值的敏感度和特異性Tab. 3 Sensitivities and specificities according to different cut-off values

表4 不同截斷值鑒定結果比較Tab. 4 Comparison of identification results with different cut-off values

討 論

近年來隨著抗生素、激素類藥物及免疫抑制劑的廣泛應用，免疫功能受損患者不斷增加，真菌感染已成為臨床抗感染治療中較為棘手的問題[7]，不同真菌對抗真菌藥物的敏感度差異較大，因此在感染早期快速準確地鑒定出病原真菌的種類已經(jīng)成為臨床診斷和治療的關鍵[8-9]。

MALDI-TOF MS 是一種新型軟電離生物質(zhì)譜儀，主要由兩部分組成，即基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源(MALDI)和飛行時間質(zhì)量分析器(TOF)。其原理是菌體蛋白在基質(zhì)液作用下帶電荷，在激光光源轟擊下解離，帶電荷的蛋白分子經(jīng)電場加速，在真空飛行管中飛行，進入飛行時間質(zhì)譜分析器進行質(zhì)量分析，檢測器檢測到不同質(zhì)荷比(m/z)的離子，并以離子質(zhì)荷比為橫坐標，以離子峰為縱坐標形成特異性的蛋白質(zhì)組指紋圖譜，進而與數(shù)據(jù)庫中圖譜進行對比，得到鑒定結果并最終確定細菌種類。MALDI-TOF MS 具有快速、準確、高通量、操作簡便、成本低廉等優(yōu)點，近年來越來越廣泛用于臨床各種感染病原的鑒定[10-12]，尤其在酵母樣真菌鑒定中優(yōu)于傳統(tǒng)生化反應的方法，大大提高了真菌的鑒定能力[13-16]。

對于真菌的鑒定，目前采用甲酸萃取法進行標本的前處理，通過甲酸和乙腈溶液的萃取，使菌體蛋白釋放，從而獲得高質(zhì)量的蛋白譜峰。對于布魯克Microflex 系列質(zhì)譜儀，真菌鑒定的截斷值設定在2.0 以上。然而在常規(guī)工作中，甲酸萃取法比較耗時，單個標本大約用時10 min 左右，如果日常真菌鑒定樣本量較大，甲酸萃取法將不利于快速檢測，并且由于酵母樣真菌細胞壁較厚，即使采用甲酸萃取后檢測，鑒定分值也很難達到2.0 以上，致使種水平的鑒定率較低。相對于甲酸萃取法，直接涂抹法更加簡便省時，即將純培養(yǎng)菌落直接涂抹于靶板上，加1μl 甲酸覆蓋后再加1μl 基質(zhì)液即可上機檢測。國外有研究報道多中心聯(lián)合進行MALDI-TOF MS 真菌鑒定流程的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)與甲酸萃取法相比，直接涂抹法并未明顯降低蛋白譜峰的質(zhì)量，而且適當降低截斷值對鑒定準確性的影響不大，且可以提高種水平的鑒定率[17-19]。

本研究對27 個菌種，494 株臨床常見酵母菌，采用直接涂抹法制備樣本，并對該方法的截斷值進行評價。結果顯示，與測序結果進行比對，直接涂抹法進行酵母樣真菌的鑒定具有較高的正確率，可達93.7%。對于31 株鑒定錯誤的菌株，除前處理方法的影響外，還可能由于某些菌種的譜圖未存在于商品化的數(shù)據(jù)庫中，如庫德里阿茲威氏畢赤酵母菌和奇異酵母菌，盡管鑒定分值不低，但卻未得到正確的鑒定結果，對于這一類菌株的鑒定，可通過在開放的數(shù)據(jù)庫中增加更多菌種的譜圖來完善。

以質(zhì)譜鑒定分值為數(shù)據(jù)繪制ROC 曲線，本研究確定的直接涂抹法進行酵母菌鑒定的截斷值為1.6。按照原采用的甲酸萃取法截斷值，鑒定分值大于2.0 為可信的種水平株鑒定結果，494 株菌中只有37 株的鑒定結果可信，采用1.6 為閾值，384株菌獲得可信的鑒定結果，所以與原截斷值相比，大大提高了菌種的鑒定正確率，經(jīng)分析，差異有統(tǒng)計學意義。

綜上所述，通過對494 株臨床常見酵母菌鑒定數(shù)據(jù)的分析，采用直接涂抹法進行標本前處理具有較高的正確率，截斷值1.6 是較為適宜的鑒定閾值，可提高酵母樣真菌的鑒定率。由于不同國家、地域真菌感染類型和菌種分布不同，確定的截斷值可能會有所差異，實驗室可收集各自醫(yī)院的臨床菌株進行評估，選取適宜的截斷值進行基于MALDI-TOF MS 的酵母菌的鑒定。