ESR1基因多態性與膝骨關節炎患病風險的相關性研究

鮑亮，張兵，趙晨，劉琮，朱鵬，周濤

(西安醫學院第二附屬醫院骨外科，陜西 西安 710038)

膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種以關節軟骨破壞、關節滑膜增生、軟骨下骨硬化為主要病理特點的運動系統常見多發病[1]，X線表現為軟骨下骨質致密、關節間隙變窄、骨小梁斷裂等，臨床表現為膝關節畸形、膝關節疼痛、膝關節腫脹、活動受限等[2]。隨著人口老齡化及生活方式的改變，膝骨關節炎發病率逐年攀升，成為導致我國50歲以上男性喪失勞動能力的第二大疾病[3]。目前膝骨關節炎致病機制尚不明確，近年來國內外越來越多學者關注基因變異在膝骨關節炎中的作用。有研究發現白細胞介素1β(Interleukin 1β，IL-1β)、轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)等基因變異在膝骨關節炎發病過程中具有促進作用，IL-1β、TGF-β1基因變異可增加膝骨關節炎患病風險[4-5]。有研究認為[6]雌激素受體α(estrogen receptor 1，ESR1)基因變異可能增加膝骨關節炎發生率，但ESR1基因多態性與膝骨關節炎患病風險的具體相關性尚不清楚。因此，本研究就ESR1基因多態性與膝骨關節炎患病風險的相關性進行了相關探討，以期為膝骨關節炎早期診斷與及時治療提供新的方向，現將研究結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 經我院倫理委員會審查批準，選擇我院2017年12月至2019年4月收治的KOA患者87例作為研究組，同期在我院健康體檢者87例作為對照組。入選標準：(1)KOA符合《骨關節炎診療指南(2018年版)》中相關診斷標準[7]；(2)近3個月內未服用相關治療藥物；(3)心、肝、腎功能正常；(4)所有患者及家屬對本研究充分知情。排除標準：(1)合并有嚴重精神系統疾病；(2)繼發性骨關節炎，如類風濕性關節炎(rheumatoidarthritis，RA)、感染性關節炎、痛風性關節炎等；(3)合并代謝性疾病或內分泌系統疾病；(4)合并系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)。研究組：男性61例，女性26例；年齡42～80歲，平均年齡(62.15±8.02)歲。對照組：男性60例，女性27例；年齡40～79歲，平均年齡(63.47±7.93)歲。兩組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

表1 兩組一般資料比較

1.2 研究方法 抽取兩組外周靜脈血4 mL，置于含肝素抗凝的無菌真空采血管(陜西奇林醫療器械有限公司)中，采用DNA提取試劑盒(洛陽吉恩特生物科技有限公司)提取DNA，微量紫外分光光度計(美國DeNovix公司)進行DNA定量，取DNA為模板，加入ESR1引物(上游引物5′-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3′，下游引物5′-ATCGTGGGCCGCTCTAGGCACC-3′)、TaqDNA合成酶(西安齊岳生物科技有限公司)進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增。PCR反應體系：10×Ex TaqBuffer5 μL，10 mmol/L引物各1.0 μL，25 mmol/L MgCl 4μL，2.5 mmol/L dNTP混合液4.5 μL，5 U/μL Ex Taq DNA聚合酶0.2 μL，80～200 ng DNA模板，加水至50 μL。PCR反應條件為：95℃預變性5 min，94℃變性20 s，75℃退火延伸1 min，循環35次。取10 μL ESR1 PCR產物，加入限制性內切酶Xbal、Pvu Ⅱ消化4 h，酶切產物于2%瓊脂糖凝膠電泳下分析ESR1酶切產物，與標準DNA Marker比對。

2 結 果

2.1 ESR1基因PCR產物限制性酶切結果 PCR產物經限制性內切酶Xbal消化可形成AA、AG、GG基因型(見圖1a，其中1為AA基因型，2、3、6為GG基因型，4、5為AG基因型)；PCR產物經限制性內切酶Pvu Ⅱ消化可形成TT、TC、CC基因型(見圖1b，其中1、2、5、6為CC基因型，3、4為TC基因型，7為TT基因型)。

2.2 兩組ESR1基因型和等位基因的分布情況 研究組ESR1基因Xbal位點的AA、AG、GG基因型頻率較對照組差異有統計學意義(P<0.05)，研究組ESR1基因Pvu Ⅱ位點的TT、TC、CC基因型頻率較對照組差異有統計學意義(P<0.05)，研究組ESR1基因Xbal位點的A、G等位基因頻率較對照組差異無統計學意義(P>0.05)。研究組ESR1基因Pvu Ⅱ位點的T、C等位基因頻率較對照組差異無統計學意義(P>0.05)。ESR1基因Xbal位點的AG基因型與KOA高風險發病率顯著相關(P<0.05)，ESR1基因Pvu Ⅱ位點的TC基因型與KOA高風險發病率顯著相關(P<0.05，見表2)。

a Xbal位點酶切結果 b Pvu Ⅱ位點酶切結果

表2 兩組ESR1基因型和等位基因分布情況[例(%)]

2.3 兩組ESR1基因單體型分析 研究組TG單體型分布頻率較對照組差異無統計學意義(P>0.05)，研究組CG單體型分布頻率較對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，研究組TA單體型分布頻率較對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，CA單體型在研究組中分布頻率顯著高于對照組(P<0.05)。單體型CA與KOA高風險發病率顯著相關(P<0.05，見表3)。

表3 兩組ESR1基因單體型分析[例(%)]

3 討 論

膝骨關節炎是由于膝關節局部損傷、炎癥或慢性勞損引起膝關節軟骨變性及活動障礙的退行性骨關節病，好發于40歲以上的中老年人群。其病理過程復雜，遺傳因素、肥胖、炎癥、超負荷活動、關節應力平衡失調、骨質疏松等均與膝骨關節炎的發生相關。另有研究發現[8-9]，IL-1β-511 TC基因型人群對膝骨關節炎的易感性可能增加，攜帶TGF-β1-509位點CC基因型患膝骨關節炎風險高。由此可見基因變異在膝骨關節炎發病過程中扮演重要角色。

已有研究證實[10]膝骨關節炎的發生與雌激素調節有一定聯系，雌激素受體α基因多態性與女性膝骨關節炎發病有關。雌激素是一種小分子類固醇激素，由雌性動物卵巢和胎盤分泌產生。雌激素具有廣泛而重要的生理作用：(1)雌激素可通過作用于子宮內膜而參與人體生殖系統的調節。(2)雌激素可通過調節膽固醇代謝而減少細胞粘附分子(cell adhesion molecule，CAM)形成，從而保護心腦血管。(3)雌激素可通過調節海馬中神經分化來影響中樞神經系統發育。(4)雌激素可抑制破骨細胞分化，增加腸道鈣吸收，以此調節人體骨骼系統。而雌激素在體內生理作用主要是通過雌激素受體(estrogen receptor，ESR)的介導來實現的，ESR主要分布在子宮、骨骼、膀胱、乳房、尿道、皮膚、大腦，包括位于細胞核內的ESRα(ESR1)、ESRβ(ESR2)，它們在機體內的分布具有組織/細胞特異性，可通過結合靶基因上的雌激素應答元件(estrogen response element，ERE)而發揮“基因型”調節效應，還可參與生殖、學習、記憶、認知等方面的調節[11]。Xbal、Pvu Ⅱ是ESR1基因最常見的兩個多態性位點，均分布于第1內含子上，Xbal存在A和G的變異，Pvu Ⅱ存在堿基T和C的變異，這些變異可能影響ESR1功能[12-13]。有學者發現[14]ESRl數量增多會使雌激素對受體感受性增加從而導致乳腺增生癥(mammary hyperplasia，HDB)發生。另有研究發現[15]ESRl基因存在高度遺傳多態性，且ESRl基因Xba I位點的變異會影響ESRI轉錄活性，從而影響雌激素對乳腺細胞的作用。本研究分析了87例KOA患者和87例健康體檢者的ESR1基因Xbal、Pvu Ⅱ的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)，結果顯示研究組ESR1基因Xbal位點的AA、AG、GG及Pvu Ⅱ位點的TT、TC、CC基因型頻率較對照組有顯著差異，說明ESR1基因多態性可能與KOA發生相關。進一步采用非條件logistic回歸分析基因型與KOA之間的關聯性，結果顯示ESR1基因Xbal位點的AG基因型及Pvu Ⅱ位點的TC基因型與KOA高風險發病率顯著相關，提示ESR1基因Xbal位點的AG基因型及Pvu Ⅱ位點的TC基因型分布頻率越高KOA患病風險可能越大。本研究單體型分析顯示CA單體型在研究組中分布頻率顯著高于對照組，單體型CA與KOA高風險發病率有一定關聯，提示單體型CA可能引起KOA發生。

綜上所述，ESR1基因多態性與膝骨關節炎發病有一定聯系，ESR1基因突變可能會增加膝骨關節炎患病風險。該研究結果有助于闡明膝骨關節炎分子遺傳學機制，為在基因水平上預測個體發病風險提供一定參考依據。但除了ESR1基因Xbal、Pvu Ⅱ位點外，ESR1基因還存在其他多態性位點協同影響KOA發生，故需結合ESR1基因其他位點作進一步研究。