白芷質量分析及標準探索研究

李珍 孟美英 楊洋 張燁 呂彩蓮 丁華（鄂爾多斯市藥品醫(yī)療器械檢驗研究中心鄂爾多斯017000）

白芷為傘形科植物白芷或杭白芷的干燥根,最早收載于《神農本草經》，臨床主要用于治療感冒頭痛、鼻塞、鼻淵、白帶等證，常用于多種中成藥組方[1]，也作為藥食同源藥材被百姓廣泛接受并普遍使用。白芷藥材主要含香豆素類化合物，現(xiàn)行標準《中國藥典》2015年版一部“白芷”項下的檢驗方法專屬性較強，基本可以控制市場上白芷的質量，但薄層鑒別和含量測定方法仍可提高完善。由于歐前胡素和異歐前胡素均為白芷的主要化學成分，但目前藥典“白芷”項下的含量測定指標為歐前胡素，國內文獻資料[2-7]對白芷中歐前胡素和異歐前胡素雖然有研究檢測，但多數(shù)沿用甲醇和水為流動相且都缺少耐用性試驗。本文在參考結合上述文獻基礎上，經過對多批次白芷的質量分析研究，建立了歐前胡素含量快篩方法。在此基礎上，又增加了白芷另一指標性成分異歐前胡素的含量測定方法，且采用HPLC法實現(xiàn)對白芷中歐前胡素和異歐前胡素兩種化學成分同時進行測定，實驗結果顯示兩種成分達到了較好的分離效果，方法簡便，重復性好。此次檢驗研究既對現(xiàn)行藥典白芷含量測定方法進行了改進，又有效控制了市場上白芷藥材的質量。

1 質量分析

本次抽取的49批白芷覆蓋了內蒙古自治區(qū)12個盟市的51家醫(yī)療機構和經營單位，由河北、內蒙古、黑龍江等7個省的36家企業(yè)生產。全項檢驗結果合格率為93.9%，所有批次性狀、鑒別、水分、浸出物項符合藥典要求，主要不合格項目集中在含量測定與總灰分檢驗。結果發(fā)現(xiàn)其理化鑒別與含量對應，彼此驗證，呈現(xiàn)正關聯(lián)。另外除水分、總灰分檢查項外，其余項目結果與外觀性狀并非理想的正態(tài)分布。這可能與藥材（飲片）的產地、來源、采收期、炮制工藝、貯存養(yǎng)護以及票據(jù)與樣品的匹配程度有一定的關系。

樣品中49%的白芷來源于河北省企業(yè)，同一生產企業(yè)生產不同批次的該藥品、同一企業(yè)生產的同一批次樣品在不同銷售地域之間、同一個企業(yè)生產的飲片在市、縣、鄉(xiāng)級各醫(yī)療單位與經營單位之間都存在質量差別。

整體來看，市場上白芷栽培品種日益增多，從性狀上觀察有明顯變化，斷面顏色出現(xiàn)黃棕色。檢查項下水分、總灰分測得數(shù)據(jù)分布相對集中，總灰分有1批超出限度。浸出物結果數(shù)據(jù)較分散，從略高于標準的15.5%至高于標準4.8倍的73.3%，數(shù)值跨度很大。含量測定總體趨勢與浸出物相似,數(shù)據(jù)分布于0.050%～0.314%，2批次低于標準值，最高值為標準值的3.7倍，且與浸出物值非正相關。二氧化硫殘留量的測定結果為14批樣品有不同程度的二氧化硫殘留，最高值為50 mg·kg-1，但均符合藥典要求。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計及綜合分析結果發(fā)現(xiàn)：性狀顏色與歐前胡素含量高低有關，橫切面顏色呈黃棕色明顯高于呈白色的白芷樣品；浸出物與含量不存在明顯的關聯(lián)；二氧化硫殘留量結果與樣品含量有關，研究發(fā)現(xiàn)經二氧化硫熏蒸后樣品歐前胡素含量會降低，這與文獻[8]結論一致。

2 探索發(fā)現(xiàn)

大量的試驗表明白芷歐前胡素含量測定項下：在白芷樣品主峰歐前胡素保留時間前10～20 min出現(xiàn)的肩峰與白芷藥材（飲片）品種及質量等其他因素有關，此峰的高低、大小不同，白芷藥材（飲片）的外觀性狀、歐前胡素含量均有所差別。實驗發(fā)現(xiàn)只需通過所得白芷樣品液相圖譜大致出峰時間及峰形，無需計算即可判斷歐前胡素的含量范圍。含量值大于等于0.138%時，色譜圖中必然在主峰歐前胡素保留時間前10～20 min之間出現(xiàn)前低后高的肩峰且響應值高；當含量值小于0.110%時，色譜圖中不出現(xiàn)前低后高的肩峰；而含量在0.110%～0.138%之間則偶爾會出現(xiàn)該峰，即只要主峰歐前胡素保留時間前10～20 min之間出現(xiàn)前低后高的肩峰，含量測定項就符合現(xiàn)行藥典規(guī)定標準。這樣借助液相色譜圖初判白芷含量大致范圍的方法，不但能檢查控制白芷的內在質量，還可實現(xiàn)部分企業(yè)方便快捷、節(jié)約成本、耗時少見效快的檢驗目的，故認為可用于白芷含量的快速初篩。色譜圖見圖1，驗證數(shù)據(jù)見表1。具體方法如下：

色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗：以十八烷基鍵合硅膠為填充劑；流動相為甲醇-水（45∶55）、乙腈-水（48∶52）、乙腈-0.1%的磷酸水溶液（48∶52）中的任一種，且流動相比例可上下浮動5%；檢測波長為300±2 nm、249±2 nm中的任一種，分離度不低于1.5，理論塔板數(shù)按歐前胡素峰計算，應不低于5000。

對照品溶液的制備：取歐前胡素對照品或含歐前胡素對照品的混合對照適量，加甲醇或乙醇配制成一定濃度的對照品溶液，濃度為 1.2～19.3 μg·min-1時最佳。

樣品溶液的制備：稱取一定量的白芷樣品，取樣量為0.1～5.0 g最佳，加一定量甲醇或不同濃度的乙醇超聲或回流提取，提取溶劑用量以5～100 mL，時間為30～60 min時最佳。取出，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

分別精密吸取對照溶液與供試品溶液各5～20 μL，注入液相色譜儀，測定，觀察色譜圖。

表1 快篩結果規(guī)律驗證表Tab1 The verification table of rapid screening

3 含量測定研究

3.1 儀器與試劑試藥：AL204-IC型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；PB211D型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；KQ-5200DE型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；U3000型高效液相色譜儀，包括紫外檢測器（賽默飛世爾科技有限公司）；1260型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）。歐前胡素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110826-201618，純度99.6%）和異歐前胡素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110827-201611，純度99.4%）。乙腈為色譜純，其他均為分析純試劑，水為離子交換高純水。

3.2 方法學驗證

3.2.1 對照品溶液的制備：精密稱取歐前胡素和異歐前胡素對照品適量，置量瓶中，加甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

3.2.2 供試品溶液的制備：取本品粉末（過3號篩）約0.4 g，精密稱定，置容量瓶中，加入甲醇約45 mL，密塞，超聲50 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.2.3 色譜條件的選擇與系統(tǒng)適應性試驗：色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Tnature（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱和 WondaCract ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；乙腈-水（48∶52）為流動相，檢測波長249 nm，柱溫30℃，進樣量20 μL，分離度不得低于1.5，理論塔板數(shù)按歐前胡素峰計，不得低于5000。

3.2.4 線性關系考察：分別精密吸取 1.25、2.5、5、10、15、20 mL 歐前胡素貯備液（濃度為 96.5124 μg·mL-1）置 100 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取1.25、2.5、5、10、15、20 mL 異歐前胡素貯備液（濃度為 93.3366 μg·mL-1），置 50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液各20 μL分別注入液相色譜儀，按“3.2.3”項下條件測定,以峰面積對進樣量進行回歸分析。結果歐前胡素、異歐前胡素分別在24.2～386 ng，46.66～746.6 ng范圍內呈良好的線性關系。回歸方程為：歐前胡素Y=1.1092X+0.0986,r=1.0000；異歐前胡素Y=0.9281X+0.2390,r=0.9998。

3.2.5 精密度與重復性試驗：取“3.2.1”項下對照品溶液，連續(xù)進樣5次，歐前胡素和異歐前胡素峰面積的RSD分別為0.14%和0.30%（n=5），證明精密度良好。

取供試品（1號樣）6份，各約 0.4 g，精密稱定，按“3.2.3”項下條件測定，歐前胡素與異歐前胡素含量值RSD依次為0.43%和0.83%（n=6），表明樣品的重復性良好。

3.2.6 穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液（1號樣），分別于0 h、5 h、10 h、18 h、24 h進行測定，歐前胡素與異歐前胡素峰面積的RSD依次為0.89%和0.64%（n=5），表明樣品在24 h內穩(wěn)定。

3.2.7 準確度試驗：取供試品9份，每份約0.20 g（1號樣，含歐前胡素 2.422 mg·g-1異歐前胡素 0.940 mg·g-1），精密稱定，置容量瓶中。各依次精密加入低、中、高質量濃度的歐前胡素對照品溶液，加入低、中、高質量濃度的異歐前胡素對照品溶液，按“3.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“3.2.3”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2、表3。

表2 歐前胡素加樣回收試驗結果（n=9）Tab2 Results of Imperatiorin recovery tests（n=9）

表3 異歐前胡素范圍與準確度考察結果表（n=9）Tab3 Results of Isoimperatorin recovery tests（n=9）

3.2.8 峰一致性及純度試驗：對比二極管陣列檢測器全波長掃描測定結果，發(fā)現(xiàn)供試品與對照品的保留時間一致，相應的紫外全掃描圖也一致，且均為單一成分。

3.2.9 耐用性試驗：換不同廠家、不同型號的色譜柱和高效液相色譜儀（色譜柱依次為 Tnature C18、WondaCract C18、WondaCract C18，液相色譜儀依次為賽默飛U3000、安捷倫1260、Waters2695），按確定的色譜條件，取重復實驗中的1號樣品進行測定。三臺儀器所測主峰的峰形良好，并且主峰與其他峰的分離度遠大于1.5，測得的歐前胡素的RSD為2.48%，異歐前胡素的RSD為2.44%，表明耐受性良好。

3.2.10 結果對比：對49批白芷樣品進行了雙成分測定，與藥典方法測定結果對比，結果表明兩種方法所測結果基本相同，進一步證明此次探索的新方法可行性高。

4 討論

4.1 質量標準亟待完善方面：第一，現(xiàn)行藥典薄層鑒別項下所用展開劑均為低沸點試劑，展開過程中容易造成試劑減少以及展開劑比例的變化，使得展距和成分分離效果不佳。針對上述情況我們進行了改進，將展開槽放入4℃冰箱的冷藏柜體，效果良好。故建議藥典添加恒溫低溫環(huán)境展開字樣。第二，含量項下流動相中，甲醇和水的組合容易導致高效液相柱壓過高，使保留時間偏移或色譜柱塌陷，為了減少接近等比例的甲醇和水流動相造成的高柱壓而選用乙腈-水（48∶52）為流動相。第三，二氧化硫熏蒸、藥材性狀顏色變化等均對含量數(shù)值有影響，應加強種植企業(yè)生態(tài)環(huán)境管理以及生產企業(yè)炮制工藝儲存方面的監(jiān)管。

4.2 現(xiàn)行標準探索發(fā)現(xiàn)問題：經過大量試驗驗證：歐前胡素保留時間前10～20 min出現(xiàn)的肩峰的高低和大小均與白芷藥材（飲片）品種及質量有關，只要主峰歐前胡素保留時間前10～20 min出現(xiàn)的前低后高的肩峰，含量項就符合現(xiàn)行藥典的規(guī)定。憑借一張色譜圖即可判斷大致的含量范圍，方法方便快捷，節(jié)省人力物力同時還大大縮短了檢驗周期，故認為可用于白芷質量的快速初篩。

4.3 含量測定研究中提取溶劑、方法、時間及流動相的選擇：參考文獻[6]，結合香豆素類物質的溶解性能，選用了乙酸乙酯、乙醚、甲醇、35%乙醇、70%乙醇以及95%乙醇為溶劑，超聲提取發(fā)現(xiàn)70%的乙醇和甲醇對異歐前胡素的提取效率相當，但甲醇對歐前胡素的提取明顯高于70%的乙醇，故確定甲醇為提取溶劑。分別采用超聲、回流提取方式和不同提取時間20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、80 min做正交試驗考察,結果顯示兩種方式的提取效率幾近相同，提取時間為50 min的提取效率最高，因此選擇超聲處理50 min，乙腈-水為流動相洗脫測定歐前胡素和異歐前胡素含量，實驗結果顯示該實驗條件下各成分峰可達到有效分離且峰形均良好，經方法學驗證各項數(shù)值均滿足要求，表明新建質量標準方法可行。