HPLC法測定蒙藥合日乎-18散中木香烴內酯含量△

崔圓圓 張躍祥 王玉華（內蒙古醫科大學藥學院呼和浩特010110）

合日乎-18散是由川木香、益智仁、生草果仁、拳參、高良姜、大黃、赤瓟子、蘇木、肋柱花、訶子、金銀花、綠豆、檳榔、土木香、甘草、肉豆蔻、琥珀、黃連等十八味藥組成，臨床功效為解毒、調經止血，用于腰腹酸痛、腹臟“黏”熱、“協日”熱、“赫依”熱等。目前，合日乎-18散沒有質量標準。川木香為方中主要藥味之一，具有行氣止痛的功效[1]。川木香隸屬菊科川木香屬，氣芳香，研究表明揮發油、木質素類和倍半萜類成分為其主要的活性成分[2，3]。木香烴內酯屬于倍半萜內酯類化合物，為川木香藥材指標性成分之一。本文采用HPLC法測定了合日乎-18散中木香烴內酯的含量，為合日乎-18散質量標準的研究奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：Waters e2695型高效液相色譜儀（沃特世科技有限公司，上海）；Mettler-Toledo MS105DU型百萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，江蘇）；Mettler-Toledo XPR10型萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，江蘇）；SBL-22DT型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司，寧波）；Heal Force NW15UV型超純水系統（河南省予華儀器有限公司，河南）；FW400A型多功能粉碎機（材茂科技有限公司，北京）。

1.2 試藥：木香烴內酯對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號111524-201911）；合日乎-18散供試品四批（呼倫貝爾市蒙醫醫院，批號 20180701、2018071901、2018081702、2018091103）；自制樣品一批（批號20190925）；甲醇為色譜純；水為超純水，所用其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件：本實驗采用Pheomenex C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇為流動相 A，水為流動相 B，梯度洗脫（0～27 min，65% A；27～31 min，65% A→80% A；31～37 min，80% A；37～39 min，80% A→65% A；39～45 min，65% A）；檢測波長為 225 nm；柱溫35℃；流速為1.0 mL·min-1；進樣體積為10 μL。理論板數按木香烴內酯峰計算應不低于4000。

2.2 對照品溶液的制備：取木香烴內酯對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含木香烴內酯0.1 mg的對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備：取供試品粉末約3.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷至室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備：按處方比例并以相同工藝制備缺川木香的陰性對照供試品，依照“2.3”項下所述供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液，即得。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性試驗：在“2.1”色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液、陰性對照溶液、供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄各自的色譜圖。色譜圖顯示，在供試品溶液色譜圖中，木香烴內酯與相鄰峰得到基線分離；陰性對照色譜圖中在與木香烴內酯對照品色譜峰對應的保留時間處無色譜峰出現，表明其他組分對木香烴內酯的測定無干擾。該方法專屬性好。

2.5.2 線性關系考察：取木香烴內酯對照品約3.0 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.119 mg的溶液，分別精密吸取上述對照品溶液 1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL和25 μL注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行測定，以峰面積對進樣量進行回歸分析。結果顯示，木香烴內酯在0.119 μg～2.7975 μg范圍內呈良好線性關系（r=0.9999），回歸方程為y=3267854.1394x-229386.9495。

2.5.3 精密度試驗：取一份供試品（批號 20180701），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下，連續進樣6幀，分別記錄色譜圖，木香烴內酯峰面積積分值之間的RSD值為0.85%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩定性試驗：取一份供試品（批號20180701），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下，分別于 0 h、3 h、4 h、9 h、12 h進樣并記錄色譜圖。結果顯示，在12 h內木香烴內酯峰面積積分值基本穩定，RSD值為0.45%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.5.5 重復性試驗：取同一批號（批號20180701）供試品6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件下，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算木香烴內酯的含量。結果表明，供試品平均含量為0.38 mg·g-1，RSD為1.70%。該法的重復性好。

2.5.6 加樣回收試驗：取已知含量（批號20180701，含量為0.38mg·g-1）的供試品9份，各約1.0 g，精密稱定，分別置9個具塞錐形瓶中，分成三組，每組三份，每組分別精密加入濃度為0.16 mg·mL-1的木香烴內酯對照品溶液各1 mL、2 mL、3 mL（約相當于供試品含有量的 50%、100%、150%）及甲醇 25 ml，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件下，進樣并記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算回收率。見表1。

表1的結果顯示，50%、100%、150%的加樣回收率的均值為96.21%，RSD為1.72%，表明該方法的準確度好。

3 供試品測定

取四批供試品（批號 20180701、2018071901、2018081702、2018091103）各兩份以及自制供試品（批號20190925）兩份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件下進行測定。含量測定結果見表2。

表1 木香烴內酯加樣回收試驗結果Table 1 Costunolide Sample Recovery Test Results

表2 供試品中木香烴內酯測定結果Table 2 Determination Results of Costunolide in the Test Samples

表2的結果顯示，四批合日乎-18散供試品及自制品中木香烴內酯含量接近，批號為2018071901的樣品含量稍高，含量在0.32 mg·g-1以上。

4 討論

4.1 流動相的選擇：參照《中國藥典》2015年版一部“川木香”含量測定項下的測定方法[1]，以甲醇-水（65∶35）為流動相進行實驗。結果顯示，木香烴內酯分離度和對稱性良好，但發現在合適的采集時間（30 min）里，不能出峰完全，第二幀里木香烴內酯會被第一幀里未出完的色譜峰影響，在連續進樣時，會出現色譜峰拖尾及保留時間漂移的現象。故嘗試流動相比例為甲醇-水（70∶30），將所有色譜峰出峰時間前移，以保證擁有合理的采集時間，但此時木香烴內酯色譜峰與其他色譜峰分離效果不佳。故將流動相比例調整為甲醇-水梯度洗脫，在保證木香烴內酯色譜峰與其他色譜峰分離度良好的前提下，使后面的色譜峰盡快沖出，縮短采集時間[5-7]。

4.2 柱溫選擇：比較了不同溫度25℃、30℃、35℃、40℃對實驗結果的影響。結果顯示，隨著色譜柱溫度的升高，整體出峰時間前移，并不會影響木香烴內酯的分離度，故在保護色譜柱的前提下，選擇柱溫為35℃[4-7]。

4.3 檢測波長的選擇：參照《中國藥典》2015年版一部“川木香”含量測定項下木香烴內酯的測定方法，選用225 nm處作為檢測波長。

4.4 超聲提取時間的選擇：為保證被測成分提取完全，在供試品細度、提取溶劑、超聲功率（250 W，頻率40 kHz）一致的情況下，考察了提取時間為20 min、30 min、40 min的提取效率。結果顯示，超聲提取20 min、30 min和40 min時，供試品中木香烴內酯的含量基本一致。故將提取時間確定為30 min，與《中國藥典》2015年版一部“川木香”含量測定項下的提取時間一致。