健脾利濕和胃膏微生物限度檢查方法的研究

鄧麗嫦 吳聲振 鄔素珍 洪美華 李聰聰

1.廣東省佛山市禪城區中心醫院，廣東佛山 528000；2.廣東省汕尾市食品藥品檢驗所，廣東汕尾 516600

健脾利濕和胃膏是醫院協定膏方，由黨參、當歸、陳皮、黃柏、佛手，雞內金、丹參、薏苡仁、炒白扁豆、白芍、神曲、山藥、茯神等二十余味藥組成的中藥復方膏劑，具有健脾和胃、利濕祛暑、寧心安神、補氣行血的功效。本膏方針對現代人生活節奏快、生活工作壓力大、飲食不節、缺少鍛煉的亞健康狀況制定方藥，適用于肢體困倦、食欲不振、腹痛、腹脹、便溏、腰膝酸痛、頭暈耳鳴、頭脹、失眠等證屬脾胃虛弱、暑濕內困的亞健康狀況人群。為了加強膏方質量控制，根據《中國藥典》2015年版四部[1]通則非無菌產品微生物限度檢查法（1105微生物計數法、1106控制菌檢查法、1107非無菌藥品微生物限度標準）的要求，建立了健脾利濕和胃膏的微生物限度檢查法并進行了驗證，確保膏方微生物檢查法的準確性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

YX280A手提式不銹鋼蒸汽消毒器（上海三申醫療器械有限公司），SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），BSC-1300Ⅱ2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司），DT300電子天平（常熟市長春儀器儀表廠），DHG-9145H鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 試驗菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）10 104]，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]和黑曲霉菌[CMCC（F）98003]，大腸埃希菌[CMCC（B）44102]由廣東環凱微生物科技有限公司提供。

1.3 試劑

氯化鈉（分析純），試驗中所用培養基購買于廣東環凱微生物科技有限公司。

1.4 樣品

健脾利濕和胃膏3批（廣東省佛山市禪城區中心 醫 院，批 號：20190310、20190420、20190508，規格：50g/瓶）。

2 方法與結果

2.1 需氧菌、霉菌和酵母菌計數方法驗證

2.1.1 菌液制備 取分別于胰酪大豆胨液體培養基30～35℃培養18～24h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌液體培養物；取于沙氏葡萄糖液體培養基20～25℃培養5～7d的白色念珠菌新鮮培養物，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每1mL≤100cfu的菌懸液。取于沙氏葡萄糖液體培養基20～25℃培養5～7d的取黑曲霉菌的新鮮培養物加入3～5mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，洗脫孢子并將菌液稀釋至每1mL≤100cfu的菌懸液。

2.1.2 供試液制備 稱取10g供試品，加入100mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，制成供試液備用（1∶10）。

2.1.3 測定方法 平皿法：平行取四份供試液（1mL/皿），其中2個平皿立即傾注15mL溫度不超過45℃胰酪大豆胨瓊脂培養基混勻，另2個注入沙氏葡萄糖瓊脂培養基搖勻，將以上平皿分別置30～35℃或20～25℃培養，需氧菌培養不超過3d，霉菌及酵母菌培養不超過5d，在3d和5d分別進行計數。

2.1.4 回收比值測定

2.1.4.1 試驗組 分別取1∶10的供試液各9mL，分別加入1mL含菌量≤100cfu的上述五種試驗菌液，混勻后吸取1mL置平皿中，馬上加入15mL胰酪大豆胨瓊脂培養基，混勻。同法制備2個平皿。另取供試液9mL，分別加入白色念珠菌菌懸液、黑曲霉菌懸液1mL混勻后，吸取1mL置平皿中，馬上加入15mL沙氏葡萄糖瓊脂培養基，混勻。同法制備2個平皿。依2.1.3法培養后做菌落計數。

2.1.4.2 菌液組 取1mL≤100cfu的上述五種菌懸液，分別置平皿中，馬上加入15mL胰酪大豆胨瓊脂培養基，混勻。各同法制備2個平皿。另取1mL≤100cfu的白色念珠菌菌懸液、黑曲霉菌懸液，置平皿中，馬上加入15mL沙氏葡萄糖瓊脂培養基，混勻。同法制備2個平皿。依2.1.3法培養后測定所加入的試驗菌數。

2.1.4.3 供試品對照組 取供試液1mL，注入平皿中，平行四份，其中2個平皿立即傾注15mL溫度不超過45℃胰酪大豆胨瓊脂培養基混勻，另2個注入沙氏葡萄糖瓊脂培養基搖勻。依2.1.3法培養后測定供試品本底菌數。

2.1.5 試驗結果 同法用平皿法驗證樣品三批，見表1。

表1 需氧菌、霉菌和酵母菌回收比值試驗結果（平皿法）（cfu）

計算公式為：

表1數據表明，供試品各試驗菌的回收比值試驗均在0.5～2，說明在實驗條件下無抑菌現象，符合微生物計數檢查驗證要求。

2.2 控制菌（大腸埃希菌）計數法驗證

2.2.1 菌液制備 取于胰酪大豆胨液體培養基上30～35℃培養18～24h的大腸埃希菌新鮮培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成菌懸液（1mL≤100cfu）。

2.2.2 供試液制備 按照2.1.2供試液項下制備。

2.2.3 試驗組 取10mL供試液（1∶10）和≤100cfu的大腸埃希菌菌液分別注入胰酪大豆胨液體培養基100mL，混勻后于30～35℃培養18～24h；取1mL上述培養物加入100mL麥康凱液體培養基，混勻后于42～44℃培養24～48h；另劃取麥康凱液體培養物于麥康凱瓊脂培養基平板上30～35℃培養18～72h。

2.2.4 陽性對照 取≤100cfu大腸埃希菌菌液加入100mL胰酪大豆胨液體培養基中，其他同試驗組。

2.2.5 陰性對照 取100mL胰酪大豆胨液體培養基，30～35℃培養18～24h；其他同試驗組。

2.2.6 試驗結果 同法驗證三個批次，見表2。

表2數據表明供試品采用常規法控制菌能正常檢出，陰性對照未檢出，在實驗條件下無抑菌現象，符合控制菌檢查驗證要求。

表2 大腸埃希菌計數法驗證結果（常規法）

上述方法驗證結果表明健脾利濕和胃膏可按平皿法進行需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數檢查，按常規法進行控制菌（大腸埃希菌）的檢查。

3 討論

2015年版《中國藥典》四部的微生物限度檢查法進一步完善了2010年版的方法并接軌國際通用標準，保障了微生物角度控制非無菌制劑的安全性和有效性[2]。按照《中國藥典》四部的要求，中成藥、醫院制劑微生物檢驗方法應該按照藥典規定完成方法學驗證后進行檢驗。 嚴曉明等[3-7]對醫院制劑進行了微生物限度檢查學的方法驗證，趙會蘭等[8-14]對中成藥進行了微生物限度檢查學的方法驗證，確保方法的完整性和檢驗結果的準確性，證明了一廠、一品、一規的藥物微生物限度檢查法在生產工藝變更、組方成分改變、檢查法修訂或檢驗條件發生改變時，也應重新進行方法學的驗證[15-16]。

實驗數據表明平皿法檢查健脾利濕和胃膏的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數，6種陽性對照菌的回收比值均在0.5～2；常規法檢查控制菌（大腸埃希菌），實驗條件下無抑菌作用。因此，可采用平皿法進行健脾利濕和胃膏的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的檢查，常規法進行控制菌（大腸埃希菌）的檢查。實驗中采用6種陽性對照菌的回收比值試驗確保了方法的準確性，方法適宜、操作簡單、重現性好，可作為健脾利濕和胃膏的微生物質量控制方法。