藤梨根提取物抗腫瘤轉移活性研究

甘椿椿 黃金玉 賈 彬 魏曉鵬▲

1.衢州職業技術學院，浙江衢州 324000；2.天津醫科大學藥學院 天津市市級藥學實驗教學示范中心，天津 300070

藤梨根為中華獼猴桃（actinidia chinensis planch）的根，為獼猴桃科獼猴桃屬植物。臨床上以單方或復方用于胃癌[1]、肺癌、卵巢癌、乳房癌[2]、肝癌[3]、直腸癌[4]等癌癥以及慢性胃炎[5]、肝炎[6]、慢性前列腺炎[7]等疾病的治療。現代藥理學研究結果表明，藤梨根具有抗腫瘤[8-12]、抗病毒[13]、抗氧化[14]、保護肝臟[15]等作用。在現有的文獻報道中對藤梨根抗腫瘤轉移方面的研究較少，本實驗對藤梨根95%乙醇提取物進行了體外抗MDA-MB-231腫瘤細胞轉移活性的篩選，結果顯示其具有較強的抗腫瘤轉移活性。

1 資料與方法

1.1 儀器

細胞培養箱（37℃，5%CO2，Thermo Fisher Scientific公司）；超凈生物工作臺（上海智誠分析儀器制造有限公司）；BIOTEX全自動酶標板分析儀（美國博騰科技公司）；CKX41倒置顯微鏡（Olympus公司）；BioDoc凝膠成像系統（美國UVP公司）；垂直電泳儀，電泳槽（美國伯樂公司）；脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；酶標板（Nest公司）；Transwell小室（美國康寧公司）。

1.2 細胞

人乳腺癌細胞MDA-MB-231（中國科學院上海細胞庫）。

1.3 試劑與藥品

RPMI-1640培養液（碧云天生物技術有限公司）；胎牛血清（FBS），PBS（HyClone）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）（Sigma）；25%（含EDTA）胰蛋白酶（Bioind）；二甲基亞砜（碧云天生物技術有限公司）；所用試劑均為分析純。藤梨根藥材于2018年7月采自浙江衢州，由衢州瑞草堂醫藥有限公司汪建剛主任中藥師鑒定，標本（B20180720）存放于衢州瑞草堂醫藥有限公司。

1.4 藤梨根95%乙醇提取物的制備

有機溶解回流提取：稱取干燥粉碎的藤梨根藥材10kg，加入5倍量95%的乙醇加熱回流提取2h，用紗布過濾提取液，如上方法提取共計3次，合并提取液，減壓濃縮，65℃真空干燥箱干燥過夜得粉末狀樣提取物403g。使用時，藤梨根提取物用DMSO溶解成高濃度儲備液，用培養液稀釋成稀釋制得設定濃度。

1.5 MTT法

用0.25%的胰酶消化MDA-MB-231細胞，用培養液（含10% FBS）配成細胞懸液，以每孔1×104個細胞接種到96孔板，每孔體積為200μL。置于37℃，5% CO2的孵箱內培養24h，24h后加入不同濃度的藤梨根提取物，繼續培養48h。之后每孔加5mg/mL的MTT 15μL，繼續孵育4h，終止培養，吸棄孔內培養上清液，每孔加150μL DMSO，振蕩10min，使結晶物充分溶解，酶標儀測定490nm處各孔吸光度。抑制率（%）=[1-（加藥組OD值/空白組OD值）]×100%。

1.6 劃痕實驗

取對數生長期細胞，0.25%胰酶消化液消化后，收集離心，用無血清RPMI-1640培養液重懸細胞，調整細胞濃度，5×105個/每孔接種于6孔板中；待細胞長至完全融合后，用10μL tip槍頭用力均勻地在培養皿中劃痕，PBS清洗2次，沿劃痕邊緣等距離間隔做上標記，以便檢測；換液后分別用不同濃度藤梨根提取物處理24h；將6孔板置于倒置顯微鏡下，觀察劃痕愈合程度并拍照，利用IPPWIN60測量細胞遷移距離，隨后進行統計學分析。

1.7 Transwell實驗

取對數生長期細胞，0.25%胰酶消化液消化，收集離心，5×104個/每孔接種于6孔板中，加不同濃度的藤梨根提取物處理24h，用無血清RPMI-1640培養液重懸細胞，1000rpm，離心5min。無血清RPMI-1640重懸細胞，調整細胞濃度為5×105個/mL。下室加入5ng/mL的EGF，500μL/孔，上室加入不同濃度化合物處理的細胞懸液200μL，將Transwell小室在37℃，5% CO2的孵箱內孵育4h，棉簽刮去上層細胞，PBS洗滌2次，4%甲醛溶液固定，蘇木精染色，PBS洗滌2次，晾干，顯微鏡下拍照，統計細胞個數，觀察穿過細胞數。

1.8 明膠酶譜法

取對數生長期細胞，計數后接種于6孔板中，每孔中細胞數目相同，置于37℃，5% CO2的孵箱內培養24h，分別加入終濃度為1、10、50μg/mL藤梨根提取物藥液（預先用不含血清的RPMI-1640培養基配制）。相同條件下繼續培養48h后，收集上清液，測定蛋白濃度（考馬斯亮藍法），稀釋至相同蛋白濃度。凝膠制備與電泳分離方法參考文獻[16-17]。MMP-9的活性用與對照組比較灰度值的百分比表示。

1.9 統計學處理

所有實驗結果數據均用SPSS22.0統計軟件進行分析，計量資料以（）表示，采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT實驗結果

不同濃度藤梨根95%乙醇提取物對人乳腺癌細胞MDA-MB-231的細胞增殖抑制作用如圖1，藤梨根95%乙醇提取物濃度為500μg/mL時能夠明顯抑制MDA-MB-231細胞的增殖，顯示出一定的細胞毒性，在100μg/mL濃度以下沒有細胞毒作用，對MDA-MB-231細胞的增殖沒有影響，從而確定非細胞毒劑量。

圖1 藤梨根提取物對MDA-MB-231細胞增殖的影響

2.2 劃痕實驗結果

測定0.01、0.1、1、10、50μg/mL 5個濃度藤梨根95%乙醇提取物在非細胞毒劑量下體外對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移的影響。藤梨根提取物能夠明顯抑制MDA-MB-231細胞的遷移，并呈一定劑量依賴性，其IC50值為14.222μg/mL。見圖2。

圖2 藤梨根提取物對MDA-MB-231細胞遷移的影響

2.3 Transwell實驗結果

進一步采用Transwell實驗，測定0.01、0.1、1、10、50μg/mL 5個濃度藤梨根95%乙醇提取物對人乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲的影響。藤梨根95%乙醇提取物能夠明顯抑制MDA-MB-231細胞的侵襲，并呈一定劑量依賴性，IC50值為16.973μg/mL。見圖3。

圖3 藤梨根提取物對MDA-MB-231細胞侵襲的影響

2.4 明膠酶譜法實驗結果

明膠酶譜法實驗測定藤梨根95%乙醇提取物對MDA-MB-231細胞分泌MMP-9活性影響，與空白對照組相比，藤梨根95%乙醇提取物能夠顯著抑制MDA-MB-231細胞分泌的MMP-9活性，且存在一定的劑量依賴性。見圖4。

圖4 藤梨根提取物對MDA-MB-231細胞分泌MMP-9活性影響

3 討論

為了研究藤梨根提取物抗腫瘤轉移作用，同時排除由于細胞毒作用對MDA-MB-231細胞的影響，采用MTT實驗檢測，確定藤梨根95%乙醇提取物非細胞毒劑量，在非細胞毒劑量前提下，測定不同濃度藤梨根95%乙醇提取物對人乳腺癌MDAMB-231細胞遷移、趨化、分泌MMP-9活性的影響。

腫瘤轉移指癌細胞從原發腫瘤脫落、遷移、粘附、浸潤進入血液或淋巴管，然后外滲二次進入組織的血液循環，并擴散至轉移開始的地方[18-19]，涉及多個步驟，是一個十分復雜的過程，其中，腫瘤細胞的遷移和基底膜的降解是非常重要的組成部分。劃痕實驗結果顯示藤梨根95%乙醇提取物能夠顯著抑制MDA-MB-231細胞的遷移，趨化運動能力，這提示了藤梨根提取物能夠在腫瘤細胞開始轉移的趨化遷移方面發揮抗腫瘤轉移作用。

細胞外基質（ECM）主要是由膠原帶白、蛋白聚糖、彈性蛋白、和細胞外基質糖蛋白構成的大分子物質，是細胞生存的重要內環境，也是阻止腫瘤轉移的第一道生物屏障。基質金屬蛋白酶（MMP）是金屬離子與細胞外蛋白酶結合而成的肽鏈內切酶，其主要作用是降解ECM和細胞之間黏著蛋白。腫瘤發生侵襲時，腫瘤細胞與基底膜表面受體結合分泌MMP，破壞腫瘤細胞周圍的基質分子，打開阻止腫瘤轉移的物理屏障，便于腫瘤細胞向外生長[20]。MMP-9是可溶性MMP家族中的重要一員，可以降解破壞細胞外基質中W、V型膠原蛋白，其與腫瘤的侵襲、轉移和血管生成密切相關[21-22]，MMP-9的表達能促進細胞的侵襲與轉移[23-24]。明膠酶譜法實驗結果表明，藤梨根95%乙醇提取物可降低人乳腺癌MDA-MB-231細胞分泌的MMP-9活性。提示藤梨根提取物通過抑制腫瘤細胞分泌MMP-9發揮抗腫瘤轉移作用。

綜上所述，藤梨根提取物具有顯著的抗腫瘤轉移的活性，其作用機制與抑制腫瘤細胞的遷移，趨化運動和侵襲有關。以上研究為中藥藤梨根的現代應用提供了實驗依據。