CRISPRCas9技術在疾病治療方面的應用

江芝瑤

【摘 要】CRISPR Cas9基因切割技術是近幾年人們在基因水平研究上的新突破，它能夠通過Cas9核酸酶實現對多個基因的切割，人們利用這個技術，能系統的了解各基因的功能和作用，并為許多遺傳性疾病提供全新的治療方式。該項技術主要通過干涉可分化干細胞、基因編輯重編程和修飾基因這三種途徑來預防和治療疾病，目前科學家們在這方面已經展開了許多研究，并取得了一定進展，實現臨床治療是CRISPR Cas9基因切割技術下一步最大的發展目標，未來該項研究也必定會獲得更為突破性的進展。

【關鍵詞】CRISPR Cas9技術;疾病;治療

【中圖分類號】R596.2【文獻標識碼】B ? ?【文章編號】1002-8714（2020）07-0123-02

CRISPR Cas9基因切割技術作為在基因水平上的一項新研究，為現代醫學領域的許多疾病治療提供了一種全新的途徑。它通過系統內的Cas9核酸酶對目標DNA進行切割，從而實現對患病基因的修復。由于CRISPR Cas9技術允許人們對基因進行高精度修復，因此對該技術展開深入研究和廣泛應用對醫學界有著重大的影響。

1 CRISPR Cas9基因切割技術介紹

CRISPR Cas9系統（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）序列系統線性排列在DNA鏈上，該系統對于原核生物來說，可以使自身體內的細菌在經歷數次病毒攻擊后自行形成免疫防御系統。

這三個功能區對于整個系統來說都有不同的作用，CRISPR序列相當于一個基因收集庫，用來編碼用來切割DNA的crRNA，它由多組重復序列組成，其中也包含小部分間區序列。Cas基因序列種類很多，有1-10等多種不同類型，它用來編碼引導crRNA切割指定DNA鏈的Cas9核酸酶，而tracrRNA就是由CRISPR序列根據其收集到的細菌信息轉錄而來。

CRISPR Cas9技術的發現可以追溯到1977年，當時桑格發明了基因測序方法，而CRISPR Cas系統的發現就開始于細菌測序中。1987年，日本大阪大學的實驗工作者在對一種大腸桿菌的堿性磷酸酶同工酶進行測序的過程中，發現在某段基因編碼序列的終止密碼子后存在一段由簡單重復序列組成的DNA片段，同時在片段兩端還存在一段不太長的特有序列，但由于當時關于生物的研究發展仍存在很多不足，學界并未對該現象展開更深入的研究。到了21世紀初，有研究者發現這種“簡單重復序列”的系統在>40%的細菌中和>90%的古生菌中都有廣泛存在，這種普遍性引起了一些科學家的重視，兩年之后，這套“簡單重復序列”被首次命名為CRISPR。經過科學家的不斷深入研究，在2005年發現這種重復序列來自于噬菌體，并且有人推測這套系統與細菌和古生菌的獲得性免疫有關，并在2007年第一次證實CRISPR的作用是獲得性免疫。之后，對于CRISPR的研究更加注重各部分的功能和整個過程的形成。比如在2008年，人們發現Spacers可以轉錄形成crRNA起到指導Cas靶向性的作用，并且證實CRISPR的靶點是DNA。一年后，科學家們又發現了TypeIII-B結構，同時進一步得出CRISPR也能夠對RNA進行切割的結論。在2011年，人們發現轉錄形成的tracrRNA和crRNA可以形成二聚體，并與Cas9組成復合體。更為重要的是人們在同一年還證實了CRISPR系統可以用在細菌和古生菌以外的其他物種，這為CRISPR Cas9技術在人類疾病中的應用做了鋪墊。緊接著，科學家們又在體外證實了Cas能夠對DNA進行切割，而2013年第一次證實CRISPR可以用于哺乳動物的編輯讓該技術成功吸引了無數生物學研究者，同時，研究人員已成功在人類、小鼠、斑馬魚及擬南芥、水稻等物種上實現精確的基因修飾。

通過科學家們不斷地深入研究，目前已知的CRISPR Cas系統主要有3種，分別是Type I、Type II和Type III。進一步根據cas基因種類分，還可以將Type II類型細分為Type IIA、Type IIB和Type IIC[1]。

2 CRISPR Cas9技術在疾病治療方面的應用以糖尿病治療為例

2.1糖尿病介紹

人體內胰島素分泌相對或絕對不足均會導致糖尿病的產生。I型糖尿病為自身免疫性疾病，其從起病之初就伴隨胰島β細胞的凋亡。II型糖尿病最初的表現為胰島素抵抗，其疾病末期也伴隨胰島β細胞的丟失。因此，治療糖尿病最重要的工作就是尋找新胰島β細胞。目前，應用CRISPR Cas9技術，可以實現從干細胞中分化、基因編輯和修飾基因三種途徑來獲取胰島β細胞。

2.2 CRISPR Cas9技術在糖尿病治療方面的應用

① 從干細胞中分化

人胚胎干細胞（hESCs）可以分化成胰島細胞。前兩種細胞也被稱為人多能干細胞，它們在表達特定轉錄因子并激活或抑制特定信號通路后，可以定向分化為胰島譜系細胞。在CRISPR Cas9技術出現以前，人們只能明確少數幾種轉錄因子的功能，而仍有很多重要信息未被發現，CRISPR Cas9技術出現之后，人們能夠利用該技術篩選胰腺發育時需要的關鍵因子，并確定其功能，從而推動人胚胎干細胞和人誘導多能干細胞分化成胰島譜系細胞。不僅如此，CRISPR Cas9技術還能夠實現將單個基因位點與患病癥狀相聯系，方便醫生針對癥狀尋找問題。隨著人們對每個物質系統的研究，有科研小組通過CRISPR Cas9技術發現NEUROG3在人胚胎干細胞分化的過程中起到非常重要的作用;而另一組研究團隊則對8個胰腺轉錄因子的作用進行了對照分析，發現PDX1不足也會影響胰腺內分泌發育;而一些中美科學家們結合CRISPR Cas9與其他一系列技術，發現胰島素不足可來源于CDKAL1、KCNJ11、KCNQ1中的基因突變，同時他們還發現，T5224這種物質可以減少由于CDKAL突變而導致的胰腺β細胞缺失，進而將T5224這種化合物研發成T5224（AP-1抑制劑）這種化學藥品，從而修復CDKAL1突變引起的胰島β細胞缺失;人們還發現STAT3 K392R突變也會導致胰島β細胞功能缺失，運用CRISPR Cas9技術可使突變恢復原來狀態，防止誘導多能干細胞不正確的分化。在相關領域，人們已經利用小鼠開展了許多嘗試，比如，有研究人員發現，插入Pax4基因可以使小鼠干細胞產生胰島素;在鼠胰腺被膜下多注射間充斥干細胞也可促進胰島素產生;把基因編輯后的胰高血糖素樣肽1基因在小鼠皮膚細胞中培養，小鼠的體重和血糖水平在4個月的時間里得到了調節和控制[1]。

② 基因編輯

在胰腺外分泌細胞、肝臟細胞、肝胰膽管細胞和胃竇細胞可通過基因編輯變為胰島素分泌細胞這一發現的基礎上，科學家們可運用CRISPR Cas9技術在胰島β細胞缺失后人工進行基因編輯，從而防止疾病發生。目前，人們已經篩選出進行基因編輯的轉錄因子最佳組合PNM，它包括了Pdx1、Ngn3和MafA三種因子，但將PNM注射入小鼠體內后發現，基因編輯效率只有20%。

③ 修飾基因

運用CRISPR Cas9技術可以修飾與引發糖尿病有關的22種相關基因，編輯單個基因是該項技術成功率相對較高的應用，但糖尿病屬于多基因遺傳病，因此難度也會相應提高。目前，修飾基因仍停留在導入正常基因來彌補缺陷基因的水平上。

2.3 展望

雖然CRISPR Cas9技術的運用為糖尿病治療提供了三種新途徑，但每種方法仍存在一定的問題。利用人體干細胞分化成胰島譜系細胞，很有可能會產生免疫排斥反應;而基因編輯的效率與成熟度較低，同時不同的成熟體細胞間表觀遺傳學存在不同，基因編輯無法進入調控胰島細胞的網絡，編輯后的細胞仍無臨床治療功能;修飾基因則無法很好保證其安全性，效率也有待提高。針對以上這些問題，研究人員開發出了一套精確度更高的脫靶效應檢測方法——“體內非靶點驗證”，或也可嘗試通過對Cas蛋白和sgRNA的改進來降低脫靶發生;為應對PAM序列的限制，人們同樣也對Cas蛋白進行了改造，獲得spCas9-NG這一變體，消除了PAM序列的限制，或也可使用Cas9直系同源酶;為應對效率低的問題，可以發明新的轉染方式或是建立更加穩定的轉導細胞系。

3 結語

CRISPR Cas9基因切割技術讓人們能夠在基因的水平上對其進行高精度的修改與編輯，這在生物學研究和醫學上都是巨大的突破。雖然CRISPR Cas9技術尚未成熟，仍存在如脫靶現象等一系列問題，但研究人員一直致力于解決目前發現的CRISPR Cas9技術有可能引發的問題，并不斷探索該技術未被發現的隱患，倘若CRISPR Cas9技術能進一步發展，那么它在研究各物質作用與功能、治療疾病等方面都將大放異彩，成為人類強有力的研究工具。

參考文獻

[1] 楊佳儒， 郭美華， 柳愛華， et al. CRISPR-Cas9的原理及其應用進展[J]. 昆明醫科大學學報， 2016， 37（5）：118-122.