miR-10b對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制*

張雪蓮， 吳維宇， 何峰

(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 四川 成都 610500)

胃癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，在中國(guó)的發(fā)病人數(shù)約占全球的40%[1]，提示中國(guó)人群具有胃癌高風(fēng)險(xiǎn)性。近年來(lái)，雖然胃癌的治療效果有所提高，但是進(jìn)展期胃癌患者的生存率仍不理想，多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)展至中晚期，導(dǎo)致干預(yù)滯后。因此，尋找有效胃癌分子標(biāo)志物，盡早診斷胃癌，對(duì)于改善患者預(yù)后至關(guān)重要。隨著表觀遺傳學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)胃癌的發(fā)生發(fā)展與很多復(fù)雜基因和信號(hào)通路有關(guān)[2-4]。miRNA作為一類(lèi)內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的特點(diǎn)，且參與多種生物學(xué)過(guò)程，可通過(guò)不同的調(diào)控途徑影響細(xì)胞的增殖和凋亡[5-6]。miR-10是近年來(lái)腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)分子，已被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-8]，但是其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響還有待進(jìn)一步研究。本研究采用熒光定量PCR方法，檢測(cè)了20例胃癌患者癌組織及癌旁組織中miR-10b的表達(dá)，探討其與胃癌細(xì)胞增殖和凋亡之間的相關(guān)性及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集和主要試劑

2018年12月確診的20例胃癌患者，男13例、女7例，年齡31～65歲、中位年齡49歲，取胃癌組織標(biāo)本和配對(duì)的癌旁正常組織標(biāo)本(距癌組織約5 cm)，立即采用液氮凍存，-80 ℃保存。人類(lèi)胃癌細(xì)胞株：高分化AGS、中分化N87、中分化SGC-7901、低分化MKN-45、低分化BGC-823和正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM(Gibco)，胎牛血清(杭州四季青)，Trizol提取試劑 (Invitrogen公司)，青霉素、鏈霉素和DMSO(Gibco BRL公司)， MTT(碧云天)，AnnexinV/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(武漢谷歌科技公司)，Lip2000轉(zhuǎn)染試劑盒和Taqman mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 胃癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含青霉素、鏈霉素及10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，于37 ℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，2 d換液1次，3 d傳代1次。將miR-NC(陰性對(duì)照物)和miR-10b轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌細(xì)胞系MKN-45細(xì)胞中，按Lip2000轉(zhuǎn)染試劑盒所提供的方法操作，轉(zhuǎn)染24 h后將細(xì)胞正常培養(yǎng)，24 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。

1.2.2胃癌組織和細(xì)胞中miR-10b及上皮型鈣黏蛋白(epithelial cadherin, E-cadherin)檢測(cè) 取癌組織以及癌旁組織研磨粉碎后，加入Trizol提取總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度法進(jìn)行質(zhì)量控制和濃度測(cè)定，確定D260/D280比值在1.7～2.0，參照Taqman mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA；以 GAPDH 或U6為內(nèi)參， 使用擴(kuò)增試劑盒對(duì) cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃、10 min、1個(gè)循環(huán)、擴(kuò)增反應(yīng)95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，30個(gè)循環(huán)。以2-△△ct計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，完成 PCR 。取5株不同分化程度的胃癌細(xì)胞株，根據(jù)其不同分化程度分為三組，即高分化組(AGS)、中分化組(N87、SGC-7901)、低分化組(MKN-45、BGC-823)，以胃黏膜上皮永生化細(xì)胞GES-1為正常對(duì)照組，檢測(cè)不同分化組細(xì)胞中miR-10b和E-cadherin的表達(dá)(檢測(cè)步驟同上)；在人胃癌細(xì)胞系MKN-45細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-10b siRNA陰性對(duì)照物后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)E-cadherinmRNA水平表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄引物miR-10b F為5′-TACCCTGTAGAACCGAATTGTG-3′，R：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT3′，以U6為內(nèi)參，反轉(zhuǎn)錄引物為R：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAAATATGGAACTGC-3′；F：5′-GGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′。E-cadherin： F：5′-ATTCTGATTCTGCTGCTCTTG-3′；R：5′-AGTAGTCATAGTCCTGGTCTT-3′；GAPDH：F：5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′；R：5′-AGTCCTTCCACGATACCAAACT-3′。

1.2.3E-cadherin和凋亡蛋白Bcl2、Bax表達(dá) 取癌組織研磨粉碎后、加入裂解液裂解，使用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取總蛋白，確定濃度后采用SDS-PAGE檢測(cè)E-cadherin和凋亡蛋白Bcl2、Bax表達(dá)量；在MKN-45細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-10b siRNA、陰性對(duì)照物，在GES-1中轉(zhuǎn)染miR-10b mimics后[9-10]，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)E-cadherin以及凋亡蛋白表達(dá)。

1.2.4MKN-45細(xì)胞增殖能力 收集MKN-45對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞并轉(zhuǎn)染miR-10b siRNA，陰性對(duì)照物為MKN-45對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-10b mimics、陰性對(duì)照物GES-1細(xì)胞后，調(diào)整濃度為5×107/L的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中24、48 h，終止前每孔加入噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)試劑 20 mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，上機(jī)前吸棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150mL，水平搖床搖動(dòng)30 min，在酶標(biāo)儀(570 nm波長(zhǎng))上測(cè)量吸光度OD值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制率(IR)=(1-試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-10和E-cadherin在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，胃癌組織中miR-10b的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與癌旁組織比較，胃癌組織中E-cadherin的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：(1)與癌旁組織比較，P<0.05。圖1 miR-10和E-cadherin在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 The expression of miR-10b and E-cadherin in gastric cancer and adjacent tissues

2.2 miR-10b和E-cadherin在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)

分別以U6和GAPDH作為內(nèi)標(biāo)對(duì)照結(jié)果顯示，正常的對(duì)照細(xì)胞(GES-1)幾乎不表達(dá)miR-10b，在高分化細(xì)胞株AGS和中分化N87和SGC-7901中僅弱表達(dá)，但是在低分化的BGC-823、MKN-45細(xì)胞株中，miR-10b的表達(dá)高于對(duì)照細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；相反，E-cadherin在高分化組中表達(dá)較高，在中分化組中表達(dá)有所降低，而在低分化組中降低最為明顯，與對(duì)照細(xì)胞相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 miR-10b和E-cadherin在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)Tab.1 The expression of miR-10b and E-cadherin in gastric cancer cell lines

2.3 胃癌細(xì)胞MKN-45的凋亡

與MKN-45對(duì)照組相比，MKN-45-siRNA組轉(zhuǎn)染miR-10b siRNA抑制miR-10b的表達(dá)后，人胃癌細(xì)胞MKN-45中E-cadherin的表達(dá)升高；進(jìn)一步在GES-1中轉(zhuǎn)染miR-10b mimics后，與GES-1對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)E-cadherin表達(dá)降低(P<0.05)，提示在MKN-45細(xì)胞內(nèi)，miR-10b對(duì)細(xì)胞凋亡因子的調(diào)控可能是通過(guò)影響E-cadherin的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。見(jiàn)圖2。

注： A為在MKN-45細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-10b siRNA抑制其表達(dá)后的相關(guān)蛋白的表達(dá)， B為在GES-1細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-10b-mimics增強(qiáng)其表達(dá)后的相關(guān)蛋白的表達(dá)；(1)與對(duì)照組比較，P<0.05。圖2 miR-10b對(duì)人胃癌細(xì)胞MKN-45中E-cadherin表達(dá)的影響Fig.2 Effects of miR-10b on E-cadherin expression in human gastric cancer cell line of MKN-45

2.4 miR-10b對(duì)人胃癌細(xì)胞MKN-45增殖的影響

與MKN-45對(duì)照組相比，MKN-45-siRNA組轉(zhuǎn)染miR-10b siRNA 24和48 h，胃癌細(xì)胞MKN-45的生長(zhǎng)增殖抑制率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與GES-1對(duì)照組相比，在GES-1中轉(zhuǎn)染miR-10b mimics后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 轉(zhuǎn)染miR-10b siRNA 24和48 h后細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制率的影響Tab.2 Effects of miR-10b siRNA transfection on cell growth and proliferation in 24 and 48

3 討論

胃癌作為臨床常見(jiàn)疾病，其發(fā)病機(jī)制繁雜，一直以來(lái)是困擾胃癌治療的瓶頸，目前研究結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞株分化級(jí)別與其轉(zhuǎn)移能力呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，提示低分化的胃癌細(xì)胞更易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變[11]。因此，盡早的識(shí)別低分化胃癌細(xì)胞危險(xiǎn)標(biāo)志物，為胃癌可防可治提供了可能性。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)胃癌的眾多發(fā)病機(jī)制中，表觀遺傳學(xué)改變可能發(fā)揮重要作用。microRNA(miRNA)作為表觀遺傳學(xué)說(shuō)的重要組成部分，是近些年在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸，具有高度的物保守性。生物體內(nèi)的miRNA對(duì)其靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)節(jié)氣道非常重要的作用，當(dāng)miRNA和靶向mRNA完全或幾乎完全互補(bǔ)時(shí)，可導(dǎo)致目的mRNA的降解，而當(dāng)miRNA和靶向mRNA不完全互補(bǔ)時(shí)，則參與負(fù)調(diào)控翻譯過(guò)程，阻礙蛋白質(zhì)翻譯[12-13]。miRNA-10b在包括乳腺癌[14-16]、胰腺癌[17-18]等多種腫瘤中的異常表達(dá)已有報(bào)道，但是對(duì)于其在胃癌中的表現(xiàn)還尚不明確。本研究結(jié)果顯示，不同分化程度的胃癌組織和細(xì)胞內(nèi)miR-10b表達(dá)情況存在較大差異，其中在低分化胃癌組織和細(xì)胞中，均觀察到miR-10b表達(dá)明顯高于對(duì)照組，提示miR-10b作為胃癌細(xì)胞低分化異常改變的可疑靶分子具有重要意義，但是其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)影響機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。

目前，miRNA參與調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡異常是最常見(jiàn)，也最顯著的生物學(xué)功能[19-21]，但所涉機(jī)制復(fù)雜，E-cadherin是介導(dǎo)上皮細(xì)胞間粘附的跨膜糖蛋白，在上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，在細(xì)胞外鈣因子參與下介導(dǎo)同種親和性細(xì)胞間的粘附。當(dāng)其表達(dá)下調(diào)或功能障礙時(shí)，將使同種細(xì)胞失去黏附，易從原發(fā)病灶脫落分離，向局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[22]研究結(jié)果顯示，在不同分化的胃癌組織和細(xì)胞中，高分化組細(xì)胞內(nèi)E-cadherin表達(dá)最高，中分化組中表達(dá)有所降低，而在低分化組中降低最為顯著，提示低分化組易發(fā)生轉(zhuǎn)移。

有報(bào)道顯示，E-cadherin可能是miR-10b的潛在靶基因[23]提示在低分化組胃癌細(xì)胞和組織中，E-cadherin的異常低表達(dá)可能與miR-10b有關(guān)。為此，我們?cè)诘头只赴┘?xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-10b siRNA抑制miR-10b的表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)E-cadherin表達(dá)增加，同時(shí)，細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)升高，抗凋亡蛋白表達(dá)下降，增殖下降；而在正常對(duì)照組中進(jìn)一步轉(zhuǎn)染miR-10b mimics促進(jìn)miR-10b的表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)E-cadherin蛋白表達(dá)下降，同時(shí)，細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)降低，抗凋亡蛋白表達(dá)增加，增殖增加。

綜上所述，在低分化胃癌細(xì)胞株內(nèi)，miR-10b的異常表達(dá)可作為可疑靶標(biāo)，且異常高表達(dá)的miR-10b可影響細(xì)胞的增殖與凋亡，而這種調(diào)控作用可能是通過(guò)影響E-cadherin的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。