大鼠β-arrestin2基因過表達慢病毒載體的構建與鑒定*

陳思思， 周恒， 王繼春， 謝菁， 周艷麗， 盧帥， 盧力

(武漢大學人民醫院 心內科， 湖北 武漢 430060； 武漢大學 心血管病研究所， 湖北 武漢 430060； 心血管病湖北省重點實驗室， 湖北 武漢 430060)

β-arrestins是G蛋白偶聯受體，包含了β-arrestin1與β-arrestin2[1]。β-arrestins是一個關鍵性的調節因子，亦可與多種信號分子直接結合、并調節其活性，參與多種生物活動過程[2-4]。除了調節機體的炎癥和免疫反應過程，β-arrestins還被發現是細胞遷移、凋亡中的關鍵調節因子[5-7]。血管內皮功能障礙是許多心血管疾病的發病基礎，而內皮祖細胞通過遷移、增殖、凋亡等參與了血管內皮修復及新生血管形成過程[8-11]。目前對β-arrestin2調節內皮祖細胞過程中的作用尚不明確，所以本次試驗采用基因重組技術建立β-arrestin2表達慢病毒載體，系統地研究基因功能對心血管疾病的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質粒和病毒 過表達質粒載體為GV492，元件順序Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，克隆位點為BamHI / AgeI，慢病毒輔助包裝質粒為Helper1.0和Helper2.0，由上海吉凱基因化學技術有限公司提供。慢病毒包裝細胞為293T細胞由美國ATCC公司提供。

1.1.2主要試劑和儀器 1 kp DNA ladder Marker(美國Fermentas)，In-FusionTMPCR Cloning Kit(美國Clontech)，250 bp DNA ladder Marker(上海捷瑞)，瓊脂糖(上海賽百盛)，E001-02B Taq polymerase(上海SinoBio)，D4030A脫氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)(日本Takara)，引物設計及合成(上海捷瑞)，限制性內切酶(美國NEB)，質粒抽提試劑盒(美國Promega)，改良伊戈爾培養基(dulbecco modified eagle medium，DMEM)(美國Hyclone)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天根)，胎牛血清(上海微科)，胰酶(上海化學試劑)，脂質體Lipofectamine 2000(美國Invitrogen)及HIV-1 p24 Antigen酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)2.0試劑盒(北京達科為)；聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀(美國Applied Biosystems)，凝膠成像儀(上海天能)，ABI3730型全自動DNA測序儀(上海美季)，HI-9211K型細菌搖床(太倉華利達)，細菌培養箱(上海一恒)，穩壓DNA電泳儀(美國BioRad)，Gilson移液器(法國吉爾森)，TGL-16G-A高速離心機(日本日立)。

1.2 方法

1.2.1目的基因片段的獲取 根據Pubmed數據庫中大鼠Arrb2(β-arrestin2，NM-012911)的cDNA序列，引物由上海捷瑞生物設計合成，予以PCR，得到目的基因(表1)。PCR反應體系配制：ddH2O、5×PS Buffer和dNTP Mix分別為32.5、10.0和4.0 μL、10 μmol/L上游和下流擴增引物均為1 μL、10 mg/L模板和PrimeStar HS DNA polymerase分別1.0和0.5 μL；PCR反應條件確定為98 ℃預變性5 min、98 ℃變性10 s、55 ℃退火10 s及72 ℃延伸90 s，合計30個循環，72 ℃延伸8 min；瓊脂糖凝膠電泳鑒定所得到的PCR產物，再予以回收和純化。

表1 PCR引物序列Tab.1 The sequences of PCR primers

1.2.2建立、鑒定和重組質粒法 采用限制性內切酶BamHI/AgeI來雙酶切上一環節得到的回收純化的PCR產物和載體質粒，然后將二者實施連接。PCR產物與載體連接的反應體系設陽性對照組(GAPDH基因的純化PCR產物)、自連對照組(空載的質粒)及實驗組(目的基因的純化PCR產物)，將上述連接后的反應產物和感受態細胞放置在冰上30 min，90 s、42 ℃ 熱激，冰水浴孵育120 s，加LB培養基500 μL，振蕩37 ℃培養60 min；在培養皿上均勻涂上帶有抗生素的菌液，在恒溫培養箱內倒置培養12～16 h。鑒定體系配制為ddH2O和2×Taq Plus Master Mix分別吸取9.2和10.0 μL、10 μmol/L上游和下游引物均為0.4 μL，挑取單個菌落至鑒定體系中，混勻進行PCR鑒定。PCR反應條件系94 ℃預變性3 min、94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s 及 72 ℃延伸30 s，共22個循環，72 ℃延伸8 min。鑒定引物(在目的基因和載體上都分別有1個)運用于菌落PCR鑒定轉化子(表1)。鑒定的陽性克隆轉化子在LB培養基中接種，置37 ℃恒溫培養箱中培養12～16 h，得定量菌液展開測序，再與目的基因序列展開對比。最后將測序無誤的菌液接入LB液體培養基10 mL，置37 ℃恒溫培養箱中培養，時間為12 h抽提質粒。

1.2.3鑒定包裝慢病毒和感染效率 消化處于爆發式生長期的293T細胞，將細胞密度調到3.33×108/L，置于37 ℃的5%CO2培養箱中培養24 h，培養基包含1/10的血清；至細胞密度處于70%～80%時采用無血清培養基培養2 h；輔助包裝質粒15 μg與GV492-Arrb2重組質粒20 μg混合均勻，用DMEM將體積調整到5 μL，室內放置5 min；將稀釋后的質粒DNA溶液與加入的Lipofectamine 2000輕輕混合均勻，室內放置15 min；將質粒DNA/Lipofectamine 2000轉染復合物加入到293T細胞培養液中，混合均勻后放入37 ℃的5%CO2培養箱中培養6 h；換掉培養基為包含10%血清的新細胞培養基，中途使用PBS清洗，置于37 ℃的5%CO2培養箱中培養48～72 h；收集上層透明液，4 ℃下5 500 r/min離心10 min；0.45 mm的濾器針過濾上層透明液，4 ℃下25 000 r/min離心2 h，棄上清，加病毒保存液充分溶解，10 000 r/min離心5 min，分裝保存至-70 ℃環境；采用終點稀釋法來測定病毒滴度，使293T細胞感染慢病毒，通過熒光顯微鏡鑒定Arrb2重組質粒與慢病毒是否已經順利成功包裝。

2 結果

2.1 獲得和鑒定目的基因片段

瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果顯示，目的基因擴增所得到的的PCR產物大小為1 274 bp，與Pubmed數據庫中該基因片段大小一致，表明了引物序列和擴增體系的有效性和準確性。見圖1。

圖1 目的基因PCR擴增產物鑒定Fig.1 PCR amplification product identification of target genes

2.2 鑒定GV492-Arrb2重組質粒轉化子

PCR和凝膠電泳鑒定結果顯示(圖2)，陰性對照中未見條帶，排除了外源性DNA和載體對實驗結果的干擾；陽性對照(GAPDH)和核酸marker說明了擴增的有效性；陽性轉化子的PCR產物大小為728 bp，進一步對比Pubmed數據庫中大鼠Arrb2基因序列，表明上下游引物之間基因序列大小與轉化子PCR產物大小結果一致(圖3)。

注：1為陰性對照(ddH2O)，2為陰性對照(空載自連對照組)，3為陽性對照(GAPDH)，4為marker，5～12為Arrb2 1～8號轉化子。圖2 Arrb2重組質粒轉化子的鑒定結果Fig.2 Identification results of Arrb2 recombinant plasmid transformant

圖3 Arrb2重組質粒測序比對結果Fig.3 Sequence alignment results of Arrb2 recombinant plasmid

2.3 病毒的滴度和感染效率

慢病毒包裝完成后，采用終點稀釋法測定病毒滴度為5×1011TU/L；將慢病毒與293T細胞共孵育，使慢病毒進入細胞中；熒光顯微鏡觀察結果所示，病毒轉染有效的細胞帶綠色熒光，隨著病毒量增加，轉染細胞數逐漸增加，具有較高的感染效率。見圖4。

圖4 Arrb2重組慢病毒感染293T細胞(200×)Fig.4 The 293T cells infected by Arrb2 recombinant lentivirus (200×)

3 討論

β-arrestins屬于抑制蛋白arrestin家族成員，參與調節許多體內病理生理事件的發生發展，包括心血管和消化道疾病、泌尿系統和中樞神經系統紊亂等[12-13]。β-arrestins是分子量為47～55 kDa的可溶性蛋白，包含一個氨基端結構域和一個羧基端結構域，兩者由極性核連接形成靜止結構，當β-arrestins與受體結合后，極性核被磷酸基團干擾，構象異構，β-arrestins即被激活[2,14-16]。β-arrestins最初被認為僅僅參與G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)的減敏以及內化[5]，而近年來的研究發現，β-arrestins作為一種支架蛋白不僅可介導GPCR信號通路，也可以招募細胞內多種信號分子并與之結合，調節其活性，進而調控細胞遷移、凋亡等過程[6,17-19]。在對Hela和HEK293細胞的研究中發現，β-arrestin2可以結合趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)，正性調控CXCR4介導的信號通路，促進基質細胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)誘導的細胞遷移[20]。此外，有研究報道，在小鼠胚胎成纖維細胞中，β-arrestin2可以介導脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)激活，上調白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)的表達[21]，而IL-8是調節內皮細胞及內皮祖細胞功能的重要因子[22-24]。上述結果雖證實了β-arrestin2對細胞遷移及凋亡的生物學作用，但其對內皮祖細胞的調節及在心血管疾病中的作用仍未明確，尚需要更為深入的研究。

基因修飾是目前研究基因功能的重要方法之一，通過選擇適當的載體使目的基因過表達或缺失，擬研究目的基因在的實驗動物或細胞模型中的作用[25]。其中，慢病毒載體是基于人類免疫缺陷型病毒發展起來的基因治療載體，比較容易侵入分裂與非分裂細胞都，且可以實現機體內的持久表達[26-27]。慢病毒是一種自殺性病毒，中是針對目標細胞，不會侵入其他細胞，也不會利用宿主細胞滋生新興病毒顆粒，是基因修飾的最先考慮的一個載體，現階段，在基因靶點領域得到的普遍應用[28-29]。通過慢病毒載體系統，可以將目標基因整合至宿主細胞基因組內，獲得能夠穩定表達目標基因的細胞株[30-31]。本實驗利用限制性內切酶消化獲得線性化載體GV492，PCR擴增制備β-arrestin2目的基因片段，并進行重組反應，將線性化載體和目的基因片段體外環化，再進行轉化、鑒定及抽提獲取過表達慢病毒質粒。其中GV492載體的元件順序為Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，包含啟動子Ubi以保證目的基因的順利表達；3Flag標簽則有利于目的蛋白表達后的檢測，gcGFP為增強的綠色熒光蛋白，是在EGFP的基礎上增加4個氨基酸殘基突變，其熒光強度比EGFP高出60%以上，可以更好的判斷重組質粒轉染效率；而IRES為內部核糖體進入位點，在病毒翻譯調控方面起到重要作用，puromycin使質粒具有嘌呤霉素抗性，用于篩選穩定轉染的細胞。將重組質粒及病毒輔助包裝質粒共轉染293T細胞，成功構建GV492-Arrb2重組慢病毒，濃縮、純化后的慢病毒滴度和傳染效率都較高，為深入研究基因功能對心血管疾病的作用筑下根基。