骨康膠囊及其組分酢漿草及芭蕉根對大鼠軟組織損傷的治療作用*

李靖， 楊健， 劉亭， 李勇軍， 沈艷珍， 楊暢， 何彬， 王愛民**

(1.貴州醫(yī)科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室 & 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學 藥學院， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學 民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽 550004； 4.貴州維康子帆藥業(yè)股份有限公司， 貴州 修文 550200)

軟組織損傷包括急性軟組織損傷和慢性軟組織損傷，急性軟組織損傷指人體運動系統(tǒng)、皮膚以下、骨骼之外的組織受到不同致傷因素的作用，造成組織生理功能的暫時紊亂和組織急性破壞而產(chǎn)生損傷，但無骨折、脫位等[1-2]，其主要臨床表現(xiàn)為局部疼痛腫脹、局部青紫瘀斑、功能障礙等[3-4]。目前西醫(yī)常采用包扎、封閉或理療等方法進行治療，而中醫(yī)則采用外敷、內(nèi)服中藥、針灸和推拿等方法治療，且中醫(yī)藥治療軟組織損傷療效顯著[5-6]。骨康膠囊是貴州傳統(tǒng)苗藥復方制劑，主要由補骨脂、三七、續(xù)斷、芭蕉根和酢漿草組成，具有滋補肝腎、強筋壯骨、通絡止痛等功效[7-8]。臨床上廣泛用于骨性關(guān)節(jié)炎、骨折、骨質(zhì)疏松癥等病癥，療效顯著[9-11]。本課題組前期對骨康膠囊的藥效及炮制進行了系統(tǒng)性研究[12-14]，目前尚未見骨康膠囊促軟組織損傷修復的報道，本研究將骨康膠囊及其芭蕉根和酢漿草成分用于大鼠急性軟組織損傷模型，通過檢測大鼠組胺含量變化及觀察大鼠肌肉組織病理切片，探討骨康膠囊及其芭蕉根和酢漿草成分的軟組織損傷治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SD大鼠體質(zhì)量(220±20)g，飼養(yǎng)濕度40%～70%、溫度20～25 ℃的環(huán)境中，實驗前適應性飼養(yǎng)7 d。

1.1.2藥品與試劑 骨康膠囊、芭蕉根藥材、酢漿草藥材均由貴州維康子帆藥業(yè)股份有限公司提供，接骨七厘片購于湖南金沙藥業(yè)有限責任公司，0.9%氯化鈉注射液購于廣西裕源藥業(yè)有限公司，75%醫(yī)用消毒酒精購于貴州鑫源衛(wèi)生制品有限公司，大鼠組胺酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.1.3儀器 超純水機(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)、EL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、DH6000BII型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司)、Varioskan LUX多功能酶標儀(美國，Thermo公司)、Thermo fresco 17低溫高速離心機(美國，Thermo公司)、Leica成像顯微鏡(德國，徠卡公司)。

1.2 方法

1.2.1建立大鼠急性軟組織損傷模型 造模前1 d 用剃毛刀去除大鼠臀部及大腿毛，用生理鹽水擦拭干凈，在大腿腘窩上2 cm處用記號筆標記。造模前，將SD大鼠用10 %水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射進行麻醉，將大鼠左下肢拉直平放，固定在硬木板上，將1根20 cm長，直徑與砝碼相當?shù)目招乃芰瞎艽怪狈胖迷谧笙轮珮擞浱?盡可能靠近標記點)，然后用重200 g的砝碼，連續(xù)8次從空心管頂端沿空心管自由落體擊中大鼠左下肢標記處[15]，造成大鼠左下肢局部急性軟組織損傷(瘀血、腫脹)。除空白組外，其余各組均采用軟組織損傷打擊器(自制)，制造大鼠軟組織損傷模型。肉眼觀察驗證造模成功與否：造模區(qū)打擊后出現(xiàn)腫脹、皮下瘀血，但皮膚完整、無破損，觸摸左下肢無骨折脫位征象，左下肢明顯跛行，但無其他異常情況者確定造模成功。

1.2.2分組與給藥 將80只大鼠隨機分為8組，每組10只，即空白組(蒸餾水1 mL/100 g)、模型組(蒸餾水1 mL/100 g)、接骨七厘片組(陽性藥，0.320 g/kg，為成人等效劑量1.2倍)、骨康膠囊[低(0.432 g/kg)、中(0.864 g/kg)、高(1.296 g/kg)]劑量組(分別為成人等效劑量1、2、3倍)、酢漿草組(0.432 g生藥/kg，為骨康膠囊中酢漿草的含量)、芭蕉根組(0.648 g生藥/kg，為骨康膠囊中芭蕉根的含量)。藥物均以蒸餾水配制成混懸液，灌胃容積為1 mL/100 g，連續(xù)給藥7 d，1次/d。

1.2.3測定大鼠血清組胺 末次給藥后，予大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，血液室溫靜置5 min，2 500 r/min 離心5 min，收集上清，保存、備用。按試劑盒操作說明測定大鼠血清組胺含量。

1.2.4組織形態(tài)學觀察 末次給藥后30 min頸椎脫臼處死大鼠，肉眼觀察損傷局部皮下瘀血和肌肉腫脹程度。取損傷中心部位肌肉組織置10%福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察。參照文獻[5,16-17]的評分標準進行評分。(1)充血、出血：血管大片充血或灶性出血(3分)，血管較多充血(2分)，血管少量充血(1分)，無充血、出血(0分)。(2)變性壞死：組織大片壞死(3分)，組織廣泛變性(2分)，局部組織變性(1分)，無變性壞死(0分)。(3)炎癥：大量炎性細胞彌漫浸潤(3分)，較多炎性細胞片狀浸潤(2分)，少量炎性細胞散在浸潤(1分)，無炎性細胞浸潤(0分)。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清組胺水平

大鼠造模給藥7 d后，模型組血清組胺含量高于空白組(P<0.05)，而與模型組比較，接骨七厘片組、骨康膠囊(中、高)劑量組血清組胺含量降低(P<0.05)，骨康膠囊低劑量組、酢漿草組、芭蕉根組血清組胺含量無明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清組胺的變化Tab.1 Changes of serum histamine in

2.2 組織形態(tài)學觀察

空白組可見正常組織結(jié)構(gòu)肌肉，無腫脹及變性壞死，無組織水腫、出血及炎性細胞浸潤，肌纖維條理清晰；模型組可見大量炎性細胞彌漫浸潤，出血及肌纖維變性；接骨七厘片組、骨康膠囊(中、高)劑量組可見少量炎性細胞浸潤，纖維排列較整齊；酢漿草組、芭蕉根組可見較多炎性細胞浸潤、出血及肌纖維變性。組織形態(tài)學評分上，與空白組比較，模型組評分增加(P<0.01)；與模型組比較，接骨七厘片組、骨康膠囊(中、高)劑量組評分降低(P<0.05或P<0.01)，且骨康膠囊組呈劑量依賴性降低，而酢漿草組、芭蕉根組評分變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2和圖1。

表2 各組大鼠組織切片形態(tài)學評分Tab.2 Morphological score of rat tissue sections

注：A為對照組，B為模型組，C為接骨七厘片組，D為骨康膠囊低劑量組，E為骨康膠囊中劑量組，F(xiàn)為骨康膠囊高劑量組，G為酢漿草組，H為芭蕉根組。圖1 各組大鼠軟組織損傷部位HE染色結(jié)果(400×)Fig.1 Observation of soft tissue injury site of rats in each group under light microscope (400×)

3 討論

急性軟組織損傷的病理過程主要是損傷組織發(fā)生無菌性炎癥反應，導致炎癥介質(zhì)和促炎細胞因子釋放[18-19]。組胺是常見的一種炎癥介質(zhì)，當組織受到損傷時便會釋放組胺，其可通過H1受體起作用，使細動脈擴張，細靜脈通透性增加，從而加速炎癥反應[20-21]。當組胺含量降低時，炎癥反應減輕，有利于軟組織損傷修復。形態(tài)學是軟組織損傷最基本的觀察指標，也是直接反應軟組織損傷恢復情況的指標，對軟組織進行HE染色可觀察到血管、組織結(jié)構(gòu)及炎性浸潤等恢復情況[22]。制造急性軟組織損傷的方法較多，因砝碼法具有造模時間短、成功率高、方法簡單、成本小以及重復性高等優(yōu)點，故本研究采用此方法造模進行實驗[23]，并通過觀察組胺含量和軟組織形態(tài)，來考察骨康膠囊對軟組織損傷的治療作用。

實驗結(jié)果表明，接骨七厘片組、骨康膠囊(中、高)劑量組大鼠血清中的組胺含量及組織形態(tài)學評分均降低，且骨康膠囊的下調(diào)作用呈劑量依賴性。骨康膠囊主要由補骨脂、三七、續(xù)斷、芭蕉根及酢漿草組成[6-7]。據(jù)報道，酢漿草和芭蕉根具有清熱解毒、消腫止痛、利尿等功效，含黃酮、香豆素等成分，具有較好的抗炎、抑菌和抗病毒作用[24-26]，但骨康膠囊中酢漿草、芭蕉根組分作用尚未明確。為了闡明骨康膠囊藥效物質(zhì)基礎，進一步擴展其應用，本文對酢漿草和芭蕉根的軟組織損傷修復作用進行了研究。實驗結(jié)果表明，酢漿草組、芭蕉根組大鼠血清中的組胺含量及組織形態(tài)學評分均無明顯變化。說明芭蕉根、酢漿草雖然具有較好的抗炎作用，但沒有降低組胺，促進軟組織損傷修復的作用，不是骨康膠囊促進軟組織損傷修復的主藥，其在組方中的作用還有待進一步研究。綜上所述，骨康膠囊可促進大鼠軟組織損傷修復，其作用機制可能是降低受傷局部組胺含量達到鎮(zhèn)痛、消腫的作用。