貴州關(guān)嶺余甘子內(nèi)生真菌多樣性及其抗菌抗氧化活性*

蘭詠哲， 李啟瑞， 黃勁， 趙亮， 董宇華， 闞雨， 王迪， 廖萬清， 康穎倩*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025; 2.貴州省微生物與人類健康關(guān)系研究人才基地 & 貴州省普通高校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025； 4.中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué) 上海長征醫(yī)院真菌學(xué)研究所， 上海 200003)

余甘子(Phyllanthusemblica)為大戟科(Euphorbiaceae)灌木植物[1]，是中國維吾爾族、傣族、壯族及布依族等多個民族的習(xí)用藥材[2-3]。余甘子藥用部位主要是果實(shí)，目前研究也大多以余甘果為主體[3-5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，余甘子具有廣泛的抗菌能力、抗炎作用及極強(qiáng)的抗氧化能力，并且無明顯的毒副作用[6-9]。內(nèi)生真菌是指某階段生活于健康植物體內(nèi)，但不引起植物組織明顯病害癥狀的真菌[10-12]。根據(jù)Stierle等[13]提出的“內(nèi)共生理論”，內(nèi)生真菌不僅可產(chǎn)生與宿主植物次生代謝產(chǎn)物相同或者相似的物質(zhì)，還可以產(chǎn)生其它類型的活性物質(zhì)，對宿主植物生長發(fā)育、對外界環(huán)境的應(yīng)激耐受性、有效活性成分的產(chǎn)生與積累等方面有重要影響。內(nèi)生真菌在藥物開發(fā)和生物防治等方面顯示出較好的應(yīng)用價(jià)值[14-17]，可有效緩解藥用植物資源匱乏、栽培藥材品質(zhì)下降等問題[18]。研究發(fā)現(xiàn)，余甘子果實(shí)藥用價(jià)值較好[1]，但對其內(nèi)生真菌的研究還未見報(bào)道。因此，本研究通過對余甘子內(nèi)生真菌進(jìn)行研究，分析其物種多樣性，同時(shí)探究代謝產(chǎn)物的抗菌活性、抗氧化作用及其與余甘子的化學(xué)成分的相關(guān)性，以期為研究藥用植物內(nèi)生真菌及開發(fā)新的藥物資源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1余甘子和菌株 貴州省關(guān)嶺縣10月份野生健康成熟新鮮的余甘子果實(shí)，置于4 ℃冰箱保存；標(biāo)準(zhǔn)菌株由本校真菌實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2主要試劑與儀器 Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、Genstar 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR) MIX、T100 PCR儀及電泳儀(美國 BIO-RAD)、Thermo 17R小型臺式高速離心機(jī)及HH-B11恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn))。

1.2 方法

1.2.1內(nèi)生真菌的分離 取余甘子新鮮果實(shí)，采用次氯酸鈉作表面消毒處理：次氯酸鈉(含5%有效氯量)浸泡3 min，無菌去離子水洗滌2次，75%乙醇浸泡1 min，無菌去離子水洗滌3次；進(jìn)行真菌組織分離[19]，即將果實(shí)用無菌手術(shù)刀切成直徑0.5 cm大小，無菌條件下將果實(shí)塊接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～10 d，連續(xù)觀察到組織塊表面長出真菌后，挑針挑取少量菌絲放到新的PDA培養(yǎng)，同時(shí)選取表面消毒最后1次沖洗的無菌去離子水及同批次空白培養(yǎng)基作對照。

1.2.2菌株的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 根據(jù)菌落的形態(tài)、菌絲及孢子的形態(tài)進(jìn)行初步鑒定，并提取全基因組，采用轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)基因通用引物ITS-4(3′-CGTATAGTTATTCGCCTCCT-5′)、ITS-5(3′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-5′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，序列送公司測序(上海生工)；獲得的序列結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)數(shù)據(jù)庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行下載與比對，同時(shí)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，即使用Bioedit 軟件處理測序結(jié)果、并進(jìn)行序列比對，使用Mega 7選擇最佳建樹模型，構(gòu)建鄰接法(neighbor-joining method，N-J)系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3余甘子果汁制備 按1.2.1對余甘子新鮮果實(shí)進(jìn)行表面消毒處理，采用研磨器研磨取漿，12 000 r/min離心2 min，取上清，為余甘子果汁，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4內(nèi)生菌發(fā)酵液的抑菌活性測定 將分離獲得的菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基中25 ℃活化3 d，挑取活化后菌絲380 mg轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(potato dextrose broth，PDB)100 mL，25 ℃、180 r/min搖床恒溫培養(yǎng)7 d[20]，9 000 r/min離心15 min，保存上清備用，為發(fā)酵液[21]；采用溶菌肉湯(lysogeny broth，LB)和PDB培養(yǎng)基對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25922、ATCC25923、ATCC10231)進(jìn)行菌株活化[22]；5 000 r/min 離心收集大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的菌體，生理鹽水懸浮菌體并分別對各指示菌菌懸液進(jìn)行梯度稀釋，稀釋至1×106CFU/mL；取指示菌菌液100 μL分別接種于LB和PDA固體培養(yǎng)基，無菌玻璃涂布棒充分涂布；培養(yǎng)基平板中央貼上已滅菌的濾紙片(直徑5 mm)，并分別滴加發(fā)酵上清液及余甘果果汁20 μL，同時(shí)滴加生理鹽水作陰性對照，25 mg/L氯霉素作為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的陽性對照，20 mg/L氟康唑作為白念珠菌的陽性對照；采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.5真菌的抗氧化作用研究[23-24]將分離獲得的菌株用PDA平板培養(yǎng)基活化3 d，無菌打孔器(直徑0.6 cm)取1個菌餅接種于PDB培養(yǎng)基，25 ℃、180 r/min搖床活化7 d；5 000 r/min 離心2 min，獲上清液；取發(fā)酵上清液5 mL，加乙酸乙酯5 mL萃取3 h，取適量乙酸乙酯萃取液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0及10.0 g/L濃度梯度的維生素C(Vitamin C，Vc)溶液、0.6 mol/L 硫酸、28 mmol/L磷酸鈉及4 mmol/L鉬酸銨溶液，并將其等量混合制為混合液；分別移取上述不同濃度梯度的Vc溶液0.1 mL于試管中，加等量混合液5 mL，95 ℃水浴加熱90 min，取試管冷卻至室溫；以不加入Vc溶液的混合液作為陰性對照，695 nm 波長測定其吸光度，繪制抗壞血酸總抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)曲線；分別取不同內(nèi)生真菌菌株的乙酸乙酯萃取液0.1 mL，同上述Vc測定方法測定其吸光度，每個菌株重復(fù)3次；同1.2.3的方法制備余甘子原漿，分別移取原漿0.1 mL及原漿的乙酸乙酯萃取液0.1 mL，同上法測定。按照Vc標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每毫升發(fā)酵液相當(dāng)于Vc的量(μg)，同時(shí)以未接種內(nèi)生真菌的空白培養(yǎng)基作為陰性對照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)生真菌的分類鑒定

健康成熟新鮮余甘子果實(shí)中分離出內(nèi)生真菌43株，其中青霉屬(PenicilliumLink)19株、橫梗霉屬(LichtheimiaVuill.)9株、間座殼屬(DiaportheNitschke)11株、葉點(diǎn)霉屬(PhyllostictaPers.)1株、葡萄座腔菌屬(NeofusicoccumCrous, Slippers & A.J.L. Phillips)3株，青霉屬為優(yōu)勢屬(圖1)；青霉屬分離出菌種2個(Penicilliumchrysogenum和Penicilliumchermesinum)，其中P.chrysogenum分離出15株，數(shù)量最多，為優(yōu)勢菌種(圖2)。

圖1 43株余甘子內(nèi)生真菌菌屬的構(gòu)成Fig.1 The genus composition of 43 endophytic fungi of Phyllanthus emblica

圖2 43株余甘子內(nèi)生真菌菌種的構(gòu)成Fig.2 The species composition of 43 endophytic fungi of Phyllanthus emblica

2.2 分離菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

對分離出的內(nèi)生真菌基于ITS序列進(jìn)行比對，每個菌屬選擇1個標(biāo)準(zhǔn)菌株，共有分離株43株，標(biāo)準(zhǔn)株5株，構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹。見圖3。

注：1為青霉屬(Penicillium)，2為橫梗霉屬(Lichtheimia)，3為間座殼屬(Diaporthe)，4為葡萄座腔菌屬(Neofusicoccum)，5為葉點(diǎn)霉屬(Phyllosticta)。圖3 43株菌株基于ITS序列的構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 43 strains based on ITS sequences

2.3 抑菌活性測試

43株內(nèi)生真菌培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液上清液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及白念珠菌均無抑制效果，但余甘子果汁對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用，對白念珠菌無抑制效果。見表1。

表1 余甘子果汁對3種標(biāo)準(zhǔn)株抑菌活性Tab.1 Antibacterial activity of P. emblica against three type strains

2.4 抗氧化能力測試

圖4 Vc標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of Vc

表2 余甘子內(nèi)生真菌發(fā)酵液的總抗氧化能力Tab.2 The total antioxidant capacity of endophytic fermentation broth from P. emblica

3 討論

本次研究從貴州關(guān)嶺地區(qū)余甘子果實(shí)中共分離出內(nèi)生真菌43株，分屬于5個屬9個菌種，包含青霉屬菌種2個(P.chrysogenum和P.chermesinum)、橫梗霉屬菌種1個(Lichtheimiaornata)、間座殼屬菌種4個(Diaporthehongkongensis、Diaporthepseudophoenicicola、Diaporthemusigena及Diaporthehickoriae)、葡萄座腔菌屬菌種1個(Neofusicoccumocculatum)以及葉點(diǎn)霉屬菌種1個(Phyllostictafallopiae)，提示內(nèi)生真菌多樣性豐富。在分離出的菌株中，青霉屬分離率為44.18%，其中P.chrysogenum分離出的菌株最多(15株)，為優(yōu)勢菌種。N-J法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，43株內(nèi)生真菌在種群分布上存在差異，分屬于5個屬的2個門。其中，青霉屬真菌被證明具有分泌多種高活性的脂肪、蛋白質(zhì)、多糖和木質(zhì)素等多聚物的酶類的功能，與植物共生時(shí)也起著一定的抗菌的作用[25]，但在本研究中未發(fā)現(xiàn)相似的功能，這可能與宿主的種類及宿主環(huán)境有關(guān)。此外，橫梗霉屬和間座殼屬占本次分離菌株的20.93%和25.58%，與青霉屬一起作為余甘子內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌屬，這些菌屬的菌株作為內(nèi)生真菌也常出現(xiàn)在其他植物中[26-27]。研究表明，這些真菌與植物病原菌有相同的生態(tài)位，在宿主體內(nèi)相互競爭營養(yǎng)、空間等，使病原菌得不到正常的營養(yǎng)供給而消亡，從而增強(qiáng)宿主抵御病害的能力[28]。

分離得到的43株內(nèi)生真菌中有2株(YGZ03和YGZ04)展現(xiàn)出較好的抗氧化效果，明顯高于空白對照，其他41株內(nèi)生真菌也有一定的抗氧化能力，但效果比之前的2株菌低，說明余甘子極高的抗氧化作用可能與它的內(nèi)生真菌有關(guān)，這在其他植物中也有相關(guān)報(bào)道[13,24]。有研究發(fā)現(xiàn)，余甘子的抗氧化作用主要與其多酚、總黃酮及Vc的含量有關(guān)[26]，植物內(nèi)生真菌往往可以產(chǎn)生與宿主植物次生代謝產(chǎn)物相同或者相似的物質(zhì)[13]，而這些化合物質(zhì)與內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物是否具有相關(guān)性，還待進(jìn)一步研究。

本研究中發(fā)現(xiàn)的2株(YGZ03、YGZ04)具有較好抗氧化作用的內(nèi)生真菌菌株均屬于葡萄座腔菌屬的N.occulatum種。該菌屬往往被認(rèn)為是引起植物病害的原因[29]。也有研究發(fā)現(xiàn)葡萄座腔菌屬的一株J11菌株具有產(chǎn)紫杉醇的能力[18]，但該菌屬并沒有作為抗氧化菌株引起人們的注意，而抗氧化性可以有效增強(qiáng)植物的抗逆性，本次研究也發(fā)現(xiàn)了該菌屬作為植物內(nèi)生真菌的新的功能。

綜上所述，本研究結(jié)果表明貴州關(guān)嶺地區(qū)余甘子內(nèi)生真菌資源豐富，分屬于2個門5個菌屬；余甘子果汁具有較強(qiáng)的抑菌能力，但內(nèi)生真菌無明顯抑菌效果。此外，發(fā)現(xiàn)43株內(nèi)生真菌均具有一定的抗氧化活性，其中2株抗氧化活性較好。