利用線粒體DNA對飛機撞擊后鳥類殘體的分子鑒定

馮 慧， 王 璐， 馮成利

(陜西省秦嶺珍稀瀕危動物保育重點實驗室 陜西省動物研究所， 西安 710032)

隨著PCR和DNA測序技術的發展，物種鑒定技術從傳統的宏觀形態鑒別發展到依靠核酸鑒別。線粒體DNA(mtDNA)具有分子結構簡單、進化速率快、無重組、多拷貝及嚴格的母系遺傳等特點[1-2]，可以敏感地區分種內和種間DNA序列的細微差異[3-4]，該技術廣泛應用于哺乳類、鳥類、魚類和昆蟲類物種的分類。

本文對2019年6月收到的一起鳥類撞擊飛機殘體進行形態鑒定，并選擇mtDNA細胞色素b基因(Cytb)和細胞色素氧化酶Ⅰ基因(COⅠ)進行分子鑒定。通過測序得到的待測鳥類mtDNA序列和GenBank已發表序列構建系統進化樹，確定鳥類殘體的物種類別。探討Cytb序列和COⅠ序列作為DNA條形碼對鳥類進行物種鑒定的準確性和實用性。鑒定結果可以為飛機抗撞擊實驗提供準確數據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品來源于西安飛機工業公司試飛站，飛機撞擊后鳥類殘體。包括一個初級飛羽，一些帶少許肌肉的絨毛。

1.2 實驗方法

1.2.1 形態學鑒定

根據殘留初級飛羽形態，參照文獻[5-8]，并輔助研究所內的鳥類標本，進行形態學鑒定。

1.2.2 DNA提取

DNA提取采用Promega公司的動物組織DNA提取試劑盒，按照試劑盒使用手冊對鳥類殘體組織進行全基因組DNA提取。

1.2.3 mtDNACytb序列和COⅠ序列的PCR擴增、測序

mtDNACytb序列的PCR擴增采用一對鳥類mtDNACytb通用引物，L14851：5′-CCTACTTAGGATCATCGCCCT-3′，H16065：5′-GTCTTCATCTCCGGTTTAC AAGAC-3′[9]；COⅠ序列的PCR擴增采用一對鳥類mtDNACOⅠ通用引物，L6615：5′-CCTCTATAAAAAGGTCTACAGCC-3′，H7956：5′-GGGTAGTCCG AGTATCGTCG-3′[10]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。Taq酶、dNTP、10×PCR Buffer購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

PCR反應體積為(50 μL)：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 1.5 μL，DNA模板2 μL，上下游引物(20 μmol/L)各2.5 μL，Taq酶0.4 μL，超純滅菌水補齊至50 μL。……