頭孢菌素酰化酶高β-折疊區(qū)保守氨基酸附近位點(diǎn)突變研究

任 羽, 常 瑞, 王繼蓮, 馬劉峰, 王 東

(喀什大學(xué) 葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 喀什 844000)

頭孢菌素酰化酶(Cephalosporin acylase)能夠一步催化頭孢菌素C(Cephalosporin C，簡(jiǎn)稱CPC)生成7-氨基頭孢烷酸(7-Aminocephalosporanic acid，簡(jiǎn)稱7-ACA)，后者是醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)頭孢菌素的中間體。但頭孢菌素酰化酶通過(guò)一步酶法對(duì)CPC的催化活性低，遠(yuǎn)未達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求[1]。因此，有必要對(duì)頭孢菌素酰化酶(CPCase)進(jìn)行分子改造，以使其適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)需要。

頭孢菌素酰化酶是通過(guò)間隔肽連接α-亞基和β-亞基而構(gòu)成的二聚體蛋白，各國(guó)學(xué)者已針對(duì)β-亞基如何與CPC結(jié)合并催化其脫酰生成7-ACA這一科學(xué)問(wèn)題開(kāi)展了各種研究。梅婷等[2]對(duì)CPCase分子中影響活性的Y150、Q220和F347氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體Y150W/Q220G/F347Y的比活力提高至原來(lái)的8.3倍。Ishii等[3]將Met269突變?yōu)門(mén)yr，發(fā)現(xiàn)酰化酶對(duì)CPC的一步轉(zhuǎn)化率提高為原來(lái)的2.5倍。Ren等[4-5]對(duì)酶的Hisβ70等關(guān)鍵活性位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)能夠獲得活性為原來(lái)的2倍的突變酶。Tian 等[6]通過(guò)計(jì)算酶設(shè)計(jì)的方法發(fā)現(xiàn)，單點(diǎn)突變L154βF，Y167βF，L180βF及其組合L154βF/L180βF和L154βF/Y167βF/L180βF能夠改善酶的穩(wěn)定性和活性。劉新花等[19]通過(guò)氨基酸的溫度因子(B因子)指導(dǎo)頭孢菌素C酰化酶的分子改造，發(fā)現(xiàn)突變體R218Q和K226V均可提高CPC 酰化酶的穩(wěn)定性和催化效率。基于理性設(shè)計(jì)的定點(diǎn)突變常用來(lái)改造酶蛋白的性質(zhì)和研究蛋白質(zhì)的特定位點(diǎn)，具有快速、直接、準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)，在酶和蛋白質(zhì)的分子改造上應(yīng)用廣泛[7-9]。

本研究以來(lái)源于Pseudomonassp. SE83的CPCase基因序列為模板[10]，對(duì)其基因進(jìn)行全局優(yōu)化設(shè)計(jì)[11]，人工合成目的基因，并克隆至表達(dá)載體pET28a，克隆命名為WT。……