復方氨基酸（15）雙肽（2）注射液異常毒性及降壓物質方法學研究

肖佳音，李慶忠，田冰

黑龍江省藥品檢驗研究中心，哈爾濱 150088

生化藥品是指從動物器官、組織、體液、分泌物中經前處理、提取、分離、純化等制得的安全、有效、質量可控的藥品，主要包括蛋白質、多肽、氨基酸及其衍生物、多糖、核苷酸及其衍生物、脂、酶及輔酶等［1］。生化藥注射劑是注射劑中較特殊的一類，按照化學藥品質量控制方式很難控制其質量［2］，且有關生化藥不良反應的報道時有發生［3-6］。因此，完善生化藥注射劑的質量標準對于保障臨床用藥安全具有重要意義。

1 試驗材料

1.1 儀器

AL204 電子天平（METTLER TOLEDO）；PL602-S電子天平（METTLER TOLEDO）；RM6000 多導生理儀（日本光電工業株式會社）。

1.2 試藥

復方氨基酸（15）雙肽（2）注射液（生產企業：哈爾濱三聯藥業股份有限公司；批號：Y140528E1、Y140531E1、Y140531E2；規 格：500 mL：67 g）；原研樣品（生產企業：Fresenius Kabi Austria GmbH；批號16HB0093；規格：500 mL：67 g）。磷酸組胺（批號150510-200412，中國食品藥品檢定研究院）；氯醛糖（批號：BCBK9603V，SIGMA 公司）；滅菌注射用水（批號1408043，天津藥業集團新鄭股份有限公司）；氯化鈉注射液（批號140113D17，哈爾濱三聯藥業有限公司）。

1.3 試驗動物

小鼠，80 只，昆明種，體重17～20 g，雌雄各半，購自長春億斯實驗動物技術有限責任公司，生產許可證號：SCXK（吉）2011-005；貓，4 只，體重2.7～3.5 kg，雄性。小鼠飼養環境為屏障環境，貓飼養環境為普通級環境，許可證號：SYXK（黑）2014004，溫度（23±2）℃，濕度（55±10）%。

2 試驗方法

2.1 異常毒性檢查法限值的確定

2.1.1 設定限值前研究因本品為大輸液，先以靜脈注射最大劑量0.8 mL/20 g 體重給予小鼠，結果小鼠即刻死，故測定LD50。

LD50預試驗：取昆明種小鼠20 只，體重17～20 g，雌雄各半，分成5 組，每組4 只，進行LD50預試驗。以1∶0.7 為劑量比，按原液0.80、0.56、0.39、0.27、0.19 mL/只五個劑量分別尾靜脈注射，注射速度為0.1 mL/s，觀察72 h。試驗結果見表1。同時比較原研樣品，結果基本一致。

表1 小鼠的LD50預試驗結果

LD50正式試驗：在預試驗的基礎上，取昆明種小鼠60 只，體重17～20 g，雌雄各半，隨機分成6 組，每組10 只。以1∶0.9 為劑量比，用氯化鈉注射液稀釋，各組劑量分別相當于原液0.40、0.36、0.32、0.29、0.26、0.24 mL/只，藥物采用低比稀釋法配制，給藥體積為0.50 mL/只，尾靜脈注射給藥，給藥后觀察動物毒性反應及死亡情況，連續觀察72 h，記錄動物毒性反應狀況和死亡動物分布。

表2 小鼠的LD50正式試驗結果

因為第一組和第二組死亡動物數均為10 只，故第一組不參與計算。第二至第六組實驗結果用改進寇氏法計算LD50值及95%可信限，結果見表3。

表3 小鼠的LD50測定結果

實驗結果顯示，復方氨基酸（15）雙肽（2）注射液靜脈注射LD50值為1 974.24 mg/kg，95%可信限為1 874.74～2 073.74 mg/kg。

2.1.2 限值的確定《中國藥典》2015 版四部［7］通則9301 注射劑安全性檢查法應用指導原則中規定，異常毒性的限值可采用小于LD50可信限下限的1/4。本品半數致死量為1 974.24 mg/kg，95%可信限為1 874.74～2 073.74 mg/kg，LD50可信限下限的1/4為468.68 mg/kg，折合小鼠體重為9.37 mg/20 g·bw，因靜脈注射體積為0.50 mL，即應將本品稀釋成18.74 mg/mL。綜上所述，為便于計算將本品的異常毒性檢查項的限值“取本品，加氯化鈉注射液制備成7 倍的稀釋液（1∶6 稀釋），依法檢查（《中國藥典》2015 版四部通則1141 異常毒性檢查法），靜脈注射給藥，應符合規定”。

2.1.3 驗證以上述限值進行了3 個批次的檢驗，結果均符合規定。結果見表4。

表4 異常毒性檢查法驗證

2.2 降壓物質檢查法限值的確定

2.2.1 限值確定前研究選取靈敏度測試合格的貓按照《中國藥典》2015 版四部通則1145 降壓物質檢查法進行了兩次預試驗，取復方氨基酸（15）雙肽（2）注射液（以下簡稱受試樣品）及原研樣品以不同給藥體積對貓降壓作用進行了預試驗，靈敏度測試及預試驗結果見表5-8。

表5 靈敏度測試第一次預試驗結果

表6 降壓物質檢查法第一次預試驗結果

表7 靈敏度測試第二次預試驗結果

表8 降壓物質檢查法第二次預試驗結果

2.2.2 限值的確定上述試驗結果表明，該供試品本身有一定的降壓作用，和原研樣品基本一致，根據預試驗結果，我們將貓體重每1 kg 靜脈注射0.5 mL原液作為限值，同樣符合指導原則［7］中“按最大無降壓反應劑量的1/2～1/4 作為劑量限值”這一原則。故將降壓物質檢查項設定為“取本品，依法檢查（《中國藥典》2015 版四部通則1145 降壓物質檢查法），按貓體重每1 kg 靜脈注射0.5 mL，應符合規定”。

2.2.3 驗證以上述限值對3 個批次的樣品進行了3次驗證，見表9-11，結果均符合規定。

表9 降壓物質檢查法第一次驗證試驗

表10 降壓物質檢查法第二次驗證試驗

表11 降壓物質檢查法第三次驗證試驗

3 結論

根據以上試驗結果，我們認為應在原標準安全性檢查項中增加異常毒性及降壓物質檢查項。其中異常毒性檢查項限值設定為“取本品，加氯化鈉注射液制備成7 倍的稀釋液（1∶6 稀釋），依法檢查（《中國藥典》2015 版四部通則1141 異常毒性檢查法），靜脈注射給藥，應符合規定”，降壓物質檢查項限值設定為“取本品，依法檢查（《中國藥典》2015 版四部通則1145 降壓物質檢查法），按貓體重每1 kg靜脈注射0.5 mL，應符合規定”。

4 討論

復方氨基酸（15）雙肽（2）注射液為腸外營養制劑，適用于不能口服或經腸道補給營養，以及通過這些途徑補充營養不能滿足需要的患者，尤其適用于中度至重度分解代謝狀況的患者。在其原標準中安全性檢查項只收載了細菌內毒素檢查項，不足以起到保證臨床用藥安全的作用。國家食品藥品監督管理總局在2008 年1 月10 日發布的《關于發布化學藥品注射劑和多組分生化藥注射劑基本技術要求的通知》（國食藥監注［2008］7 號）中提到，涉及到多組分生化藥特性的安全性指標應訂入標準，如過敏物質、降壓物質、異常毒性等。考慮到本品種為15 種氨基酸組成的水溶液，在合成過程中存在氨基酸脫羧形成組胺或類組胺物質的可能，且用理化分析方法受到多種因素干擾［8-9］，難以分析，故考慮增加降壓物質檢查項；同時，考慮到其在生產過程中有新生雜質或污染物的可能并引起不正常的毒性反應，故擬增加異常毒性檢查項。