洋蔥組織培養及遺傳轉化研究進展

惠林沖，陳 微，李威亞，楊海峰，何林玉，郇國磊，王江英，徐衛平，李景芳，繆美華，陳振泰，潘美紅*

(1.連云港市農業科學院，江蘇 連云港 222000；2.江蘇省云臺農場有限公司，江蘇 連云港 222000)

洋蔥(AlliumcepaL.)是重要園藝蔬菜之一，已有4000多年的栽培歷史，被世界各地廣泛栽培[1]。洋蔥遺傳背景復雜，單株自交系統選育純合的種質資源困難，同時洋蔥是二年生植物，選育周期長；雜種優勢明顯，生產中以洋蔥細胞質雄性不育(CMS，cytoplasmic male sterility)系選育雜交種，國內外已開發出篩選不育系的分子標記cob[2]、orfA501[3]、Cpp1[4]和orf725[5]，篩選保持系的分子標記jnurf13[6]、AcSKP1[7]、DNF-566、RNS-357[8]、OPT和PsaO[9]，加速了洋蔥雜交育種的選育進程。針對市場和育種方向需求，急需選育既有優良農藝性狀和商品性狀，同時又抗逆的親本材料，這通過常規育種手段難以實現。組織培養技術和現代分子技術的應用，促進了植物育種發展，尤其是轉基因和基因編輯技術成熟。目前在洋蔥轉基因技術研究中，已有報道將抗草甘膦和膦環素的除草劑基因轉入洋蔥材料中，但轉化頻率最高為0.9%[10]，轉基因技術應用于洋蔥的突破性進展仍顯不足；另外，基因編輯(genome editing)是對生物體基因組進行靶向修飾的一項新技術。該技術利用核酸酶在特定位置產生的雙鏈DNA 損傷，通過非同源末端連接和同源重組修復機制，實現在特異目標位置DNA 的插入、刪除或特定DNA 片段的替換[11]。利用CRISPR/Cas9 系統分別在雙子葉植物擬南芥[12]、煙草及單子葉植物水稻[13]和小麥[14]中成功實現了對內源靶基因的定點編輯。在洋蔥中還未見相關報道，其中構建CRISPR/Cas9載體系統技術相對成熟，但與轉基因技術一樣，關鍵基礎核心技術是農桿菌介導轉入洋蔥愈傷成苗體系的建立，大部分研究依然集中在愈傷遺傳轉化效率這個核心問題，利用轉基因或基因編輯新技術選育新品種還有一定的距離。筆者針對國內外洋蔥組織培養和遺傳轉化的研究進行了綜述，對洋蔥組織培養的外植體材料、愈傷組織誘導、植株再生及生根的配方進行了探討，同時對基因編輯技術在洋蔥中應用提出了研究方向。

1 洋蔥愈傷組織誘導的研究

1.1 洋蔥愈傷組織誘導的外植體類型

國內外科研人員對洋蔥的愈傷誘導的技術已非常成熟，但因不同的基因型、不同外植體材料的原因，洋蔥愈傷組織的誘導率各不同，建立高效的誘導愈傷組織體系至關重要。目前洋蔥外植體選擇主要有種子，種子萌發的胚芽、莖尖、根尖，鱗莖盤、花蕾、試管苗葉片和幼嫩花序等(表1)。分析37份文獻報道，蔥屬材料愈傷組織誘導培養基中利用種子作為外植體占60%，其中一部分是種子消毒后，在培養基上培養24 h，剝離成熟胚(21%)、胚根(7%)、根尖(10%)、幼苗莖尖(16%)，另一部分直接將種子放入培養基上誘導(10%)；利用洋蔥球底部的鱗莖盤為外植體占16%，而利用頂部幼嫩花序、未成熟胚和葉片作為外植體的較少(2%)，葉片接種后逐漸玻璃化，很難誘導出愈傷[15]；其他外植體均能誘導出愈傷組織。外植體使用頻率較高的是種子中成熟胚、幼苗莖尖，鱗莖盤和花蕾。

表1 洋蔥不同外植體愈傷組織誘導

雖然洋蔥種子取材方便，不受季節、時間限制，然而在操作上需要無菌操作，且先預培養，切開種子取胚、胚根等，然后轉移到另一個培養基中，勞動強度大，技術要求高，容易污染。鱗莖盤和花蕾操作上比較方便，從本課題組操作經驗看鱗莖盤比較方便，尤其是洋蔥球的鱗莖盤，容易消毒，取樣方便，數量多，污染率較低；而花蕾盡管取樣方便、數量多，但污染率較高，花期短，花蕾取樣大小不容易控制。洋蔥種球存儲達4個月以上，鱗莖盤外植體要優于花蕾外植體[39]。值得注意的是花蕾作為外植體未經過愈傷組織可以直接誘導多個芽結構[36,52]。洋蔥幼嫩花序作為外植體很少有研究，與花蕾一樣取樣周期短，但王建軍等研究發現其愈傷誘導率達100%[38]。本課題組也利用22份洋蔥資源的花序進行愈傷誘導，誘導率為100%，且污染率低，取樣方便，數量多。

1.2 洋蔥愈傷誘導的品種基因型

洋蔥愈傷誘導中基因型的選擇非常重要，有的能夠直接誘導出愈傷，有的不能直接誘導出。對12個蔥屬植物進行愈傷誘導發現，有些品種從胚胎發生的愈傷組織培養中再生出芽，有些盡管誘導出愈傷但在光照下無綠色組織形成[21]。洋蔥品種780愈傷誘導明顯優于其他兩個品種N-2-4-1、Hisar-2[31]；不同洋蔥基因型能夠誘導出愈傷，但誘導率也存在明顯的差異，對8個不同基因型研究發現，最高出愈率為84.0%, 最低為42.8 %[32]；在研究的16個品種中，愈傷組織誘導率最低為50.5%[44]。Zhang等對洋蔥的13個處理中，以atm24品種為最優，總的再生率為4.62%[24]]，說明不同外植體愈傷組織和再生芽存在顯著的基因型差異，高度依賴于所使用的品系。

1.3 洋蔥愈傷組織誘導的培養基及培養條件

培養基的配方是組織培養重要的成分，通過提供必要的營養物質來調節植物組織的生長和形態。MS、B5和BDS是在洋蔥愈傷組織誘導中常使用的基礎培養基。BDS培養基是Dunstan等在添加了銨、磷和氮的改良B5培養基。研究發現以BDS為基礎培養基，洋蔥愈傷組織的鮮重比B5增加了40倍[17]。以洋蔥、水稻、玉米、大豆、棉花、煙草、覆盆子和非洲菊為試驗材料，對愈傷組織生長、植株再生、微繁殖率、毛狀根生長和次生代謝產物比較發現BDS的培養效果與MS或B5相同或更好[37]。以B5為基礎培養基比較少，主要集中在1970～1980年，1995年至今大部分以MS為基礎培養基，在MS培養基上誘導和繼代培養的愈傷組織再生時產生的芽和根明顯多于在BDS培養基上繼代培養的愈傷組織[24]。目前，MS已經商品化，購買渠道和操作方便、生產批次和配方穩定(表1)。部分研究報道在MS的基礎上添加了B5所含有的維生素[43,45]，優化了洋蔥愈傷所需的營養成分。

應用于洋蔥愈傷組織誘導的激素主要有2,4-D、激動素KT(KT)、PIC(Picloram)、BA(benzylaminopurine)、2iP[6-(3-methyl-2-buten-l-ylamino)-purine]等，使用最多的是2,4-D，使用的濃度范圍在0.1～4.0 mg/L，因基因型的差異，大部分篩選的最佳濃度是1 mg/L或2 mg/L 2,4-D(表1)。Zheng等研究發現洋蔥愈傷組織的誘導和再生在很大程度上取決于2,4-D的濃度，而品種、蔗糖濃度和培養基類型則不那么重要[24]。洋蔥品種Stuttgarter Giant在含有2.5 μmol/L 2,4-D 的B5上獲得了堅硬、稻草色、球形、外觀鮮艷的愈傷組織；當2,4-D的濃度降低至1.25 μmol/L時并沒有導致愈傷鮮重和干重的減少[19]。KHAR等研究認為MS添加0.5 mg/L 2,4-D最有利于莖尖、根尖和種子的愈傷組織形成，2,4-D濃度的降低或增加導致愈傷組織形成的減少，2,4-D濃度超過一定水平會抑制愈傷組織的再生或導致形態形成能力的喪失和核型不穩定[31]。當NAA濃度大于0.05 mg/L時，愈傷生長受限。但是當0.05 mg/L NAA與0.14 mg/L 2,4-D結合時，愈傷組織的生長速度與在0.28 mg/L 2,4-D的培養基中相同，只有先在NAA/2,4-D組合上啟動了胚根愈傷組織時，才會產生芽[20]。

PIC(Picloram)已被有效地用作可長期再生洋蔥組織培養的生長素來源，在胚性愈傷誘導及植株再生方面優于2,4-D。同一洋蔥品種的不同外植體使用Picloram誘導愈傷組織所需的濃度也不一樣，莖尖和根(0.5 mg/L)和種子(1.0 mg/L)誘導愈傷組織形成，當Picloram濃度從1～5 mg/L增加反而導致愈傷組織誘導頻率顯著降低。培養基中BA和TDZ促進了洋蔥深綠色愈傷組織的形成，但BA未誘導芽的形成[31]。不同濃度的蔗糖(10、20和30 g/L)對洋蔥和青蔥的愈傷組織誘導和植株再生沒有顯著影響[24]。培養基中添加酪蛋白水解物可提高愈傷組織的誘導頻率，而添加谷氨酰胺無明顯影響[31]。

洋蔥愈傷組織誘導培養條件中，溫度均在24～26 ℃，而培養的光照條件各不相同，有黑暗和光照兩種，且均能誘導出愈傷組織，但黑暗的培養條件較多(表1)。

1.4 洋蔥愈傷組織的類型及繼代培養

洋蔥(單子葉)愈傷組織通常有胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織。而在洋蔥愈傷組織誘導中出現兩種不同類型：水性易碎型和干燥緊密型(圖1)。水性易碎型：呈水狀、透明狀，無明顯結構，由細長的管狀空泡化細胞組成，細胞間聯系松散，并由一個薄的分生組織帶引導。干燥緊密型：表面干燥，有廣泛的分生組織區，而在愈傷組織中心形成較大的空泡型薄壁細胞，由小細胞組成，細胞質致密，原皮發育良好[25]。區分胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織：胚性愈傷組織是脆性愈傷組織，而非胚性愈傷組織含有大量水分[34]；胚性愈傷組織通常是致密的和結節狀的，在顯微鏡下觀察可與非胚性愈傷組織區分開[21]；胚性愈傷組織的掃描電鏡(SEM)分析顯示，胚性愈傷組織有球形、鱗狀和桿狀[44]。緊湊型愈傷組織比水性愈傷組織具有更好的再生能力，胚胎具有明顯的莖和根分生組織[21,24]，適合作為洋蔥胚性愈傷組織再生體系加以研究，而水性易碎型適合作為洋蔥液體懸浮培養或原生質體的制備。

圖1 洋蔥干燥緊密型(A)和水性易碎型(B)愈傷組織

為獲得更多的胚性愈傷組織，Tiwari等將胚性愈傷組織移入液體培養基中，實現了胚性愈傷的快速生長懸浮培養，所獲得的球狀胚性愈傷組織大量再生。用等體積的新鮮培養基代替老培養基，每15 d傳代一次，植株再生頻率高且表型正常[35]。酪蛋白水解物能顯著改善愈傷組織類型，在顯微鏡下觀察發現奶黃色愈傷組織易于形成胚性懸浮液[19,31]。低濃度的6-BA在繼代培養基中可以促進胚性愈傷組織的形成。添加2.0 mg/L甘氨酸、690 mg/L脯氨酸和1.0 mg/L酪蛋白水解物也增加了愈傷組織誘導和胚性愈傷組織形成的頻率[40]。20 g/L蔗糖和硫胺素(VB1)也能促進體細胞胚的成熟，當正常MS培養基中VB1濃度由0.1 mg/L增加到10 mg/L時，體胚發芽率達到93.3%[42]。

洋蔥愈傷組織長期的繼代培養染色體會發生變異和再生頻率的降低。Daveya等利用洋蔥愈傷組織含硫風味物質，但無論是未分化的愈傷組織還是生根的愈傷組織都不能產生大量洋蔥特有的成分[17]。Selby等對3個洋蔥品種20個獨立的愈傷進行了9代繼代培養，篩選高產蒜氨酸酶的變異株，結果顯示蒜氨酸酶活性與正常植株相當，未篩選出能產生高水平洋蔥風味化合物的愈傷[18]。在繼代培養對洋蔥再生頻率影響方面，少于3個月的繼代培養愈傷組織材料具有很高的再生潛力，大多數(97%)的再生植株具有正常的二倍體核型(2n=16)，但非整倍體細胞數量隨年齡的增加而增加[27,29,33]。

1.5 洋蔥愈傷的液體懸浮培養

洋蔥愈傷組織在液體培養基中懸浮培養能夠大量、快速擴繁愈傷，且減少污染和人工繼代培養的工序。鱗莖盤外植體在B5固體培養基上5～6周形成愈傷組織，在液體培養基中需要2～3周，液體培養基懸浮培養比固體培養基培養愈傷組織要快。液體培養中的愈傷組織可在1周內形成根，但在液體培養中未觀察到芽或胚的形成[16]。愈傷組織培養中用于細胞懸浮起始的基因型是實現植物高效再生的關鍵。通常生長緩慢、堅硬、致密的愈傷組織，不適于液體懸浮，一般選用水性易碎型的愈傷組織，但此類型的愈傷組織再生頻率比較低。2～3周齡的供體愈傷組織是原生質體分離的最佳材料，且愈傷組織的表型也很重要：愈傷組織生長越快，越易碎，就越容易適應細胞懸浮。可以通過細網孔篩選小細胞聚集物，縮短繼代培養次數(2周)。原生質體需要復雜的有機培養基來再生細胞壁，優化培養基的滲透壓和透氣性以保持細胞膜的完整性和快速擴繁[53]。液體培養基與固體培養基在植物再生方面的差異不大，但經過較長時間的離體培養后，芽再生速度明顯下降[27]。為解決懸浮液愈傷的不良增殖的問題，Zhang等通過反復的光/暗過渡建立了穩定的懸浮培養體系[29]。Wu等建立3 L圓球型生物反應器，接種密度為5 g/L和0.1 m3/min空氣體積，最有利于洋蔥胚性愈傷組織的增殖[42]。同時，液體懸浮培養還將有利于轉基因和基因編輯技術中農桿菌的侵染和共培養研究。

2 洋蔥愈傷組織再生體系的建立

對洋蔥愈傷組織的再生過程進行組織學觀察，發現在愈傷組織表面形成胚狀結構，從球形胚發展到兩極胚的莖和根尖，與維管束相連發育成小植株。另一方面，異常的、高水化的外觀結構并沒有發育成芽或幼苗，植株的再生是通過體細胞胚形成的[30]。在已報道的30份洋蔥再生最佳培養基中，除了7份使用B5或BDS基礎培養基，其他23份都以MS為基礎培養基，其中有4份配方無任何激素，也能誘導愈傷再生(表2)。Fridboro等認為細胞分裂素對于生長和器官形成不是必需的，但會輕微刺激葉狀芽的形成，NAA或IAA刺激了愈傷組織生長和根部形成[16]。洋蔥愈傷組織在NAA培養基上只分化出多種形態和結構的根，未分化出芽[17]。而Dunstan等研究發現胚根在含有NAA/2,4-D激素組合的培養基上誘導的愈傷組織，在再生培養基上才會產生芽，5周的愈傷組織會產生更大比例的芽和綠色結節區域，產生的芽不具有綠色幼苗的習性，經常表現出末端兩裂的葉片，葉片變厚，外觀光滑[20]。在含有5.37 mmol/L NAA和4.65 mmol/L KT兩種激素組合的MS液體培養基中，培養2周后，發現芽原體，形成芽和根[33]。

表2 洋蔥愈傷組織再生體系誘導

ABA促進體細胞胚的發育和萌發，在MSK培養基中1 μmol/L ABA使兩個洋蔥品種的平均芽密度顯著增加，芽密度增加是由于每個基因型產生芽的愈傷組織的數目增加。長時間的愈傷組織繼代培養后，形成體細胞胚和植株的能力下降[21]。王建軍等利用幼嫩花序誘導的愈傷組織在添加1.0 mg/L TDZ的B5培養基上再生芽分化率達78.13%[38]。Sivanesan等在MS培養基中添加1.0 mg/L 2,4-D，植株再生頻率最高達70.1%，其次是picloram(38.9%)和2,4-D + picloram(34.5%)[44]。

通過對不同類型和濃度的細胞分裂素(BA、TDZ、ZR和ZT)與不含生長調節劑的培養基研究發現，愈傷組織只有0.25%～0.88%產生芽，對洋蔥幼苗的再生沒有促進作用。反而細胞分裂素濃度的增加導致了根的減少[27]。在分蘗洋蔥中也發現隨著6-BA濃度的升高，分化率下降[40]，但激動素增加到10 mg/L對洋蔥再生無任何影響[31]。在再生培養基中添加BAP并沒有增強愈傷組織細胞或懸浮細胞簇的芽再生，BAP的存在顯著促進了綠色愈傷組織在培養基上的誘導和生長[30]。另外在再生培養基中添加2.0 mg/L甘氨酸可促進再生頻率升高(78.1%)和植株形成(28.7株/愈傷組織)[40]。愈傷組織從誘導培養基轉入再生培養基中，植物生長激素殘留可能會對再生產生影響。活性炭(AC)可以吸收一些潛力無機離子、生長激素和酚醛樹脂，因此，將AC加入再生培養基可增加植株再生頻率[44]。近幾年，Wu等研究發現能夠在無激素的MS培養基上建立洋蔥高頻再生體系[42]。本課題組通過幾年的基因型篩選，在無激素的MS培養基誘導出苗，愈傷組織新長出綠色組織，而不是愈傷組織變綠，并逐步分化出芽結構(圖2A、圖2B)，但再生頻率較低。所以，蔥屬植物的再生高度依賴于特定基因型和胚性愈傷組織的培養周期[24-25]。

圖2 洋蔥愈傷組織誘導再生苗

洋蔥愈傷組織誘導成苗后，在添加高濃度NAA(1.5 mg/L)的培養基上, 愈傷組織生成大量根, 不產生芽；而在低濃度NAA(0.5 mg/L)培養基上, 芽大量發生, 基本不生成根[32]。在不添加任何生長調節劑的情況下將幼苗移入1/2MS或MS培養基中，可以很容易地誘導其生根[25,31]。各基因型間根的形成能力在不同培養基間差異不顯著。本課題組在誘導愈傷組織再生苗的過程中，當幼苗長出2～4片管狀葉后，根也會生長出來，無需轉移到生根培養基中(圖2C、圖2D)。

3 洋蔥愈傷遺傳轉化系體研究

研究洋蔥遺傳轉化的報道比較少，主要通過根農桿菌LBA4404(pTOK233)和EHA105(pCAMBIA1301)侵染愈傷組織進行篩選。轉化基因主要有uidA、UGS、GFP、抗除草劑、抑制催淚因子基因及轉花青素基因等(表4)。影響遺傳轉化的重要因素除了愈傷組織再生體系外，還有材料、共培養期、共培養培養基和選擇培養基等。

表4 洋蔥遺傳轉化研究成果

不同品種間GUS基因表達水平存在差異。Ashwini發現洋蔥品種CO3的GUS基因表達水平低于Bellary[45]。Zheng等[47]利用農桿菌介導β-glucuronidaseuidA基因和GUS基因表達轉化洋蔥和大蔥，發現大蔥優于洋蔥；共獲得83株轉基因植株，植株形態和染色體數目均正常；在1個轉基因洋蔥株系中也發現了基因沉默，GUS在葉片中有表達，而在鱗莖中幾乎沒有表達；而不同農桿菌品系、愈傷組織年齡、愈傷組織來源和滲透處理對共培養轉化效率沒有影響。轉基因的頻率非常低，Pablo等對gus a和nptII的特異性引物PCR分析僅獲得1株轉基因洋蔥[50]。

由于不同的植物和組織對不同的選擇劑的反應不同，因此需要大量的選擇劑。Eady等研究了抗生素、卡那霉素、潮霉素、新霉素(Geneticin)和除草劑草銨膦作為洋蔥組織培養的選擇性藥劑。卡那霉素不適合洋蔥生長，而草銨膦、新霉素和潮霉素則明顯抑制了洋蔥的生長。低水平的潮霉素(10～30 mg/L)降低了愈傷組織的生長，但顯著增加了胚性愈傷的再生頻率[54]；而Mythili等認為轉基因洋蔥中新霉素(Geneticin)是一種較好的選擇試劑[55]。減小愈傷組織的大小，從而增加對選擇劑的接觸面積，顯著提高了篩選效率[47]。

田間雜草影響洋蔥的生長和產量，目前還未有較好的除草劑應用于洋蔥田除草。已有報道將抗草甘膦和膦環素的除草劑基因轉入洋蔥材料中，用兩倍劑量的除草劑噴施，對轉基因洋蔥無影響，但轉化頻率最高為0.9%[10]。首次報道甘露糖作為洋蔥的篩選指標，開發了一種不需要使用抗生素或除草劑的洋蔥轉化篩選系統。該系統使用了大腸桿菌基因編碼磷甘醇異構酶(pmi)。轉基因植物攜帶編碼pmi的manA基因，可以通過pmi活性將6-磷酸甘露糖轉化為果糖-6-磷酸解毒。果糖-6-磷酸是糖酵解的中間產物。利用農桿菌和生物系統，分別以27%和23%的轉化率培育出轉基因植株[49]。利用農桿菌介導的愈傷組織進行RNAi抑制催淚因子基因(LFS)表達，獲得了4株轉基因株系，但在4個轉基因之間LFS酶活性和LFS蛋白有差異，可能是由于RNAi介導沉默的多樣性造成的[51]。Zheng等利用編碼蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白的基因(Bt)開發的cry1Ca和H04轉基因青蔥(shallots：AlliumcepaL.)，可有效對(亞)熱帶青蔥甜菜夜蛾產生抗性[48]。譚武平利用基因槍和農桿菌兩種方法將含花青素合成轉錄因子基因轉入洋蔥表皮，部分細胞變成紫色，同時該轉基因植株的鱗莖有花青素的積累，開發了花青素作為一種可視化跟蹤系統用于洋蔥轉基因植株早期篩選的方法[41]。

4 展望

目前已有報道建立了洋蔥完整的遺傳轉化體系，但轉化效率低，制約了洋蔥重要功能基因的驗證與應用。在很大程度上受限于基因型的材料，洋蔥愈傷組織誘導培養基的配方、培養條件均影響不大，但再生頻率低，制約了洋蔥轉基因和基因編輯技術的應用。綜合前人研究進展及本課題組的經驗，提出以下合理優化方案，以解決洋蔥愈傷誘導、植株再生及遺傳轉化的問題。第一：愈傷組織誘導是關鍵的第一步，因課題組洋蔥資源圃材料(中日照類型)多，選擇性強、方便，采用單一變量控制法，利用洋蔥幼嫩花序為外植體，作為變量因素，培養基配方固定不變，目前已建立通用型愈傷組織誘導方法，避免了因基因型的差異，設計多種配方的麻煩。第二：在愈傷組織再生苗誘導方面，曾采用常規方法對單一品種的愈傷設計激素濃度組合，大量組合均未誘導出苗；后采用無激素的MS培養基固定不變，對多種基因型的愈傷組織進行誘導，成功篩選出容易誘導出苗的品種，盡管再生頻率低，后期將對篩選出再生苗的品種進行不同激素組合試驗，以進一步提高再生頻率。第三：目前洋蔥轉基因和基因編輯技術的核心基礎研究是遺傳轉化體系的建立，雖然愈傷組織再生頻率低，但是愈傷組織非常容易誘導生根，可利用篩選出特定基因型的愈傷組織進行農桿菌侵染，優化侵染時間、共培養培養基、篩選劑，然后再誘導生根，在根中進行檢測，能夠提高工作效率。另外，如果將洋蔥的一些優質基因、抗蟲抗病基因分離和克隆出來，則將會極大地促進洋蔥轉基因和基因編輯技術的發展和應用。

表3 洋蔥組織培養最佳生根誘導培養基