不同外植體選材對珙桐愈傷組織誘導(dǎo)的影響

畢海林，黃杏娥，楊文宏，和加衛(wèi)，楊正松，楊洪濤，李 燕*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高山經(jīng)濟(jì)植物研究所，云南 麗江 674199;2.麗江藍(lán)瑪生物科技開發(fā)有限責(zé)任公司，云南 麗江 674199)

珙桐(DavidiainvolucrataBaill.)為藍(lán)果樹科珙桐屬落葉喬木，被譽為“中國的鴿子樹”，又稱“鴿子花樹”“水梨子”，野生種只生長在中國西南的四川省和中部的湖北省和周邊地區(qū)。珙桐已被列為國家一級重點保護(hù)野生植物，為中國特有的單屬植物，屬孑遺植物，也是全世界著名的觀賞植物。珙桐種子休眠期長、發(fā)芽率低、繁殖困難。因此，開展珙桐的組織培養(yǎng)技術(shù)研究可加快其繁殖速度，對保存優(yōu)良種質(zhì)資源及其合理開發(fā)利用具有重要理論意義和應(yīng)用價值。目前，有較多有關(guān)珙桐組織培養(yǎng)的文獻(xiàn)報道，畢世榮[1]、夏晗[2]、羅世家[3]、金曉玲[4]、楊鋒利[5]、余阿梅[6]、鄒利娟[7]、郭文久[8]等均對珙桐進(jìn)行了組織培養(yǎng)的研究報道，其中珙桐愈傷組織誘導(dǎo)已基本沒有問題，有的研究報道表明，誘導(dǎo)的愈傷組織能分化出芽形成完整植株，但是外植體選材與褐化問題還沒有得到徹底解決。因此，本文擬通過不同的外植體選材來摸索珙桐組織培養(yǎng)最適合的外植體。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為麗江市高山所辦公區(qū)珙桐1月初冬芽及6月初腋芽、6月底麗江市高山所辦公區(qū)及迪慶州維西縣未成熟珙桐果實、11月底麗江市內(nèi)高山所辦公區(qū)成熟果實。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體選擇及其消毒方法 (1)將冬芽及腋芽用5%洗滌劑液洗滌，流水沖洗2 h，移至無菌操作臺上，用70%酒精消毒30 s，用無菌水洗3次；再用0.1%升汞溶液消毒10 min，用無菌水洗5次，將腋芽剝?nèi)ネ鈱訋灼瑢?nèi)部芽體接種在初代培養(yǎng)基上，每瓶接1個外植體，觀察腋芽初代培養(yǎng)生長情況及統(tǒng)計污染率。

(2)將未成熟果實用5%洗滌劑液洗滌，流水沖洗2 h，移至無菌操作臺上，用70%酒精消毒30 s，再用0.2%升汞溶液消毒15 min，用無菌水洗3次，將未成熟果實用鑷子及手術(shù)刀剝?nèi)?nèi)部胚乳及胚，成熟度稍高的直接剝?nèi)∪ヅ呷榈呐撸墒於鹊涂床磺迮叩倪x擇帶胚乳的胚，剝?nèi)『蠼臃N在初代培養(yǎng)基上，每瓶接1個外植體，觀察胚及胚乳在初代培養(yǎng)基上的生長變化情況及統(tǒng)計污染率。

(3)將成熟果實除去果皮，將堅硬種子砸開，取出內(nèi)部胚乳及胚，用水浸泡24 h后，移至無菌操作臺上，用70%酒精消毒30 s，再用0.1%升汞溶液消毒6 min，用無菌水洗5次，將胚及胚乳接種在初代培養(yǎng)基上，每瓶接1個外植體，觀察胚及胚乳在初代培養(yǎng)基上的生長變化情況及統(tǒng)計污染率。

1.2.2 誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基的篩選 以MS、WPM、N6為基本培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基中蔗糖為3%、瓊脂粉為6 g/L，添加不同濃度的多種激素，培養(yǎng)基pH值為5.8，溫度為(25±2)℃，光源為日光燈，光照強度為1500～2000 lx,光照時間為12 h/d。培養(yǎng)過程中觀察各培養(yǎng)基中培養(yǎng)物的表現(xiàn)，45 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率及芽分化的情況。

1.2.2.1 初代培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 (1)以冬芽及腋芽為外植體，采用以下啟動培養(yǎng)基：

①MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA

②MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1 g/L AC+0.3 g/L PVP

③MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3 g/L結(jié)冷膠+0.3 g/L PVP

④WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA

⑤WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1 g/L AC+0.3 g/L PVP

⑥WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3 g/L結(jié)冷膠+0.3 g/L PVP

⑦N6+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA

⑧N6+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1 g/L AC+0.3 g/L PVP

⑨N6+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3 g/L結(jié)冷膠+0.3 g/L PVP

(2)以未成熟種子和成熟種子帶胚乳的胚及去胚乳的胚為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，采用以下愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：

Ⅰ.MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L ZT+0.5 mg/L 2,4-D

Ⅱ.MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA

Ⅲ.MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L ZT+0.5 mg/L 2,4-D+1 g/L AC+0.3 g/L PVP

Ⅳ.MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3 g/L結(jié)冷膠+0.3 g/L PVP

Ⅴ.WPM+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L ZT+0.5 mg/L 2,4-D

Ⅵ.WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA

Ⅶ.WPM+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L ZT+0.5 mg/L 2,4-D+1 g/L AC+0.3 g/L PVP

Ⅷ.WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3 g/L結(jié)冷膠+0.3 g/L PVP

Ⅸ.N6+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L ZT+0.5 mg/L 2,4-D

Ⅹ.N6+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA

Ⅺ.N6+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L ZT+0.5 mg/L 2,4-D+1 g/L AC+0.3 g/L PVP

Ⅻ.N6+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3 g/L結(jié)冷膠+0.3 g/L PVP

1.2.2.2 繼代培養(yǎng)愈傷組織芽分化培養(yǎng)基篩選 將初代培養(yǎng)形成的愈傷組織接種在以下培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織變化情況：

A.WPM+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA

B.WPM+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA+1 g/L AC

C.WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA

D.WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1 g/L AC

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素及抗氧化劑對珙桐冬芽及腋芽初代培養(yǎng)的影響

由表1和圖1可以看出，以冬芽為外植體，消毒后剝?nèi)ネ鈱影臃N的材料在各種培養(yǎng)基中均不明顯褐化；而夏天選取的外植體腋芽在不加抗氧化劑活性炭、聚乙烯吡咯烷酮、結(jié)冷膠的培養(yǎng)基中外植體褐化嚴(yán)重，影響愈傷組織的形成；其中加活性炭、聚乙烯吡咯烷酮的培養(yǎng)基中外植體褐化較輕，而加聚乙烯吡咯烷酮、結(jié)冷膠的培養(yǎng)基中外植體褐化不明顯，培養(yǎng)基顏色稍微均勻變深。由此可見，抗氧化劑活性炭、聚乙烯吡咯烷酮、結(jié)冷膠對珙桐腋芽初代培養(yǎng)具有顯著的抗氧化作用，其中聚乙烯吡咯烷酮和結(jié)冷膠共同作用可有效遏制外植體的褐化，結(jié)冷膠能有效分散氧化后的褐色醌類物質(zhì)，有效降低外植體因褐化引起的壞死率。在3類培養(yǎng)基中，冬芽和腋芽的外植體培養(yǎng)表現(xiàn)沒有明顯的區(qū)別。

表1 不同激素及抗氧化劑對珙桐冬芽腋芽初代培養(yǎng)的影響

A.冬芽初代培養(yǎng)情況；B.添加抗氧化劑PVP和結(jié)冷膠的培養(yǎng)基中冬芽的初代培養(yǎng)情況；C.腋芽初代培養(yǎng)情況；D.添加抗氧化劑PVP和結(jié)冷膠的培養(yǎng)基中腋芽的初代培養(yǎng)情況。

2.2 不同激素及抗氧化劑對珙桐未成熟種子和成熟種子帶胚乳的胚及去胚乳的胚初代培養(yǎng)的影響

由表2、圖2、圖3可以看出，選取珙桐未成熟種子去胚乳的胚直接作為外植體，在添加3種細(xì)胞分裂素6-BA、KT、ZT及較高濃度的生長素2,4-D的3類培養(yǎng)基中，幼胚在培養(yǎng)基中均很快變綠膨大，膨大的胚邊緣形成黃白色愈傷組織，且有的培養(yǎng)基中愈傷組織上還有點狀疑似芽點，而且無論加不加抗氧化劑PVP即聚乙烯吡咯烷酮和結(jié)冷膠，胚在整個培養(yǎng)過程中均絲毫不褐化；細(xì)微差別在于，WPM培養(yǎng)基中伸展的幼胚表面形成的愈傷組織較多，其上的點狀疑似芽點也較多。只添加細(xì)胞分裂素6-BA和較低濃度的生長素NAA的3類培養(yǎng)基中，幼胚的子葉均在7 d左右開始伸展，胚根逐漸伸長形成2～3條根，整個胚不褐化，最終均可形成完整小植株；這3類培養(yǎng)基差別不明顯。

表2 不同激素及抗氧化劑對未成熟種子和成熟種子帶胚乳的胚及去胚乳的胚初代培養(yǎng)的影響

A.胚剛開始變綠膨大；B.MS培養(yǎng)基中胚基部形成少量愈傷組織；C.N6培養(yǎng)基中胚基部形成較多愈傷組織；D.WPM培養(yǎng)基中整個胚表面形成較多愈傷組織；E.WPM培養(yǎng)基中愈傷組織上形成點狀疑似芽點。

A.MS培養(yǎng)基中子葉伸展且胚根伸長形成2～3條根的小植株；B.N6培養(yǎng)基中子葉伸展且胚根伸長形成2～3條根的小植株；C.WPM培養(yǎng)基中子葉伸展且胚根伸長形成2～3條根的小植株。

以珙桐未成熟種子帶胚乳的胚作為外植體，胚乳外表皮暴露在空氣中以后馬上被氧化變褐，以后逐漸變黑壞死，培養(yǎng)基中加了抗氧化劑聚乙烯吡咯烷酮、活性炭、結(jié)冷膠的外植體嵌入培養(yǎng)基的部分褐化程度較輕，但在以后的培養(yǎng)中也基本上沒有愈傷組織形成，加結(jié)冷膠的培養(yǎng)基中整個培養(yǎng)基顏色均稍稍加深變褐，說明結(jié)冷膠有分散褐化物質(zhì)并有效降低褐化的作用，但在此培養(yǎng)過程中，褐化程度稍輕的外植體也沒有形成愈傷組織。由此可見，珙桐未成熟種子胚乳中含有酚類物質(zhì)，極易被氧化成醌類物質(zhì)，因此不宜選珙桐未成熟種子帶胚乳的胚作為外植體。

成熟種子種皮極其堅硬，取內(nèi)部完整的胚乳及胚極其不容易，以成熟種子的胚乳及胚作為外植體，整個初代培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物稍稍膨大但變化不明顯，胚基本不伸長，但也不褐化，并且外植體消毒不容易徹底，污染率相對較高。

綜上所述，珙桐未成熟種子去胚乳的胚是一種極佳的外植體。添加3種細(xì)胞分裂素6-BA、KT、ZT及較高濃度的生長素2,4-D的WPM培養(yǎng)基中伸展的幼胚表面形成的愈傷組織較多，其上的點狀疑似芽點也較多，說明WPM培養(yǎng)基較有利于珙桐未成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)；只添加細(xì)胞分裂素6-BA和較低濃度生長素NAA的3類培養(yǎng)基幼胚均可形成完整小植株，且3類培養(yǎng)基差別不明顯。

2.3 繼代培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)分化

將珙桐未成熟種子去胚乳胚初代培養(yǎng)形成的愈傷組織轉(zhuǎn)接在分化培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織分化情況。4種培養(yǎng)基上10 d左右均出現(xiàn)少量淡綠色點狀突起，有芽分化的跡象。但繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后，淡綠色點狀突起變化不明顯，并沒有分化成芽。

3 討論與結(jié)論

本試驗選取6種外植體即珙桐冬芽、腋芽、未成熟種子去胚乳及帶胚乳的胚、成熟種子去胚乳及帶胚乳的胚，對珙桐愈傷組織誘導(dǎo)及分化進(jìn)行了研究。

以珙桐腋芽為外植體時，培養(yǎng)基中添加的抗氧化劑聚乙烯吡咯烷酮、活性炭、結(jié)冷膠對珙桐腋芽初代培養(yǎng)具有顯著的抑制褐化作用，其中聚乙烯吡咯烷酮和結(jié)冷膠共同作用可有效抑制外植體的褐化，結(jié)冷膠能有效分散氧化后的褐色醌類物質(zhì)，有效降低外植體因褐化引起的壞死率；而以珙桐冬芽為外植體時，無論培養(yǎng)基中是否添加抗氧化劑聚乙烯吡咯烷酮、活性炭、結(jié)冷膠，所接種的外植體在各培養(yǎng)基中均不明顯褐化。因此，在其他植物組織培養(yǎng)時，若所選取的外植體在初代培養(yǎng)中容易褐化，可采用聚乙烯吡咯烷酮、活性炭和結(jié)冷膠來嘗試降低褐化的影響。

以珙桐未成熟種子去胚乳的幼胚為外植體時，無論培養(yǎng)基中是否添加抗氧化劑聚乙烯吡咯烷酮、活性炭、結(jié)冷膠，幼胚在培養(yǎng)基中均不褐化，其能在培養(yǎng)基中變綠膨大，表面形成愈傷組織或者發(fā)育成完整小植株；而以珙桐未成熟種子帶胚乳的幼胚為外植體時，胚乳馬上被氧化變褐，最終變黑，由此推測胚乳中含有酚類物質(zhì)，極易被氧化成醌類物質(zhì)，因此不宜選珙桐未成熟種子帶胚乳的胚作為外植體，而應(yīng)該去除胚乳，直接以內(nèi)部的幼胚為外植體。當(dāng)幼胚發(fā)育成珙桐小植株后，可在繼代培養(yǎng)階段通過小植株莖段長高伸長來進(jìn)行珙桐試管苗的擴(kuò)繁。

以珙桐成熟種子去胚乳的胚和帶胚乳的胚為外植體時，成熟種子種皮極其堅硬，取內(nèi)部完整的胚乳及胚極其不容易，并且外植體消毒不容易徹底，污染率相對較高。雖然培養(yǎng)過程中兩者均不明顯褐化，但整個初代培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物只是稍稍膨大，變化不明顯。應(yīng)該是此時種子已經(jīng)休眠，內(nèi)部的成熟胚也已經(jīng)休眠因此在培養(yǎng)基中不萌發(fā)生長。

本試驗結(jié)果表明：珙桐未成熟種子去胚乳的幼胚是珙桐極佳的外植體，因其初代培養(yǎng)時毫不褐化；添加3種細(xì)胞分裂素6-BA、KT、ZT及較高濃度的生長素2,4-D的條件下幼胚分化形成愈傷組織；添加細(xì)胞分裂素6-BA和較低濃度的生長素NAA的條件下幼胚發(fā)育成珙桐完整小植株。繼代培養(yǎng)階段小植株莖段增殖和愈傷組織芽誘導(dǎo)分化的激素配比則有待進(jìn)一步摸索。